發(fā)布時間：2017-09-06 03:38

  本文關(guān)鍵詞：壓力調(diào)控成體干細胞復合PRF所構(gòu)建雙膜復合體成軟骨能力的體外實驗研究

  更多相關(guān)文章： 壓力 骨髓間充質(zhì)干細胞 脂肪干細胞 富血小板纖維蛋白 成軟骨

【摘要】：關(guān)節(jié)軟骨因本身無血管、淋巴、神經(jīng)組織，一旦損傷，其自身的修復能力極其有限，容易導致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，因此，臨床上一直在探求獲得功能性軟骨再生修復的治療方法。近些年來，隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，為臨床上治療軟骨損傷提供了新的研究思路。種子細胞、生長因子及支架材料作為軟骨組織工程中的三大要素，其各自均發(fā)揮著極其重要的作用。在種子細胞選擇上，骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪干細胞（Adipose-derivedstem cells，ADSCs）作為成體干細胞中重要的兩大類干細胞，因其具有較強的自我增殖能力和多向分化潛能，均被廣泛的用于軟骨組織工程的研究，但兩者之間在相同的培養(yǎng)環(huán)境下，成軟骨的能力是否存在差異卻尚不明確。在生長因子來源方面，由于外源性生長因子的供給，存在較短的半衰期及費用較高等，常給臨床應用帶來不便；富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）的出現(xiàn)就很好的解決了這一難題，PRF為高度濃縮的血小板衍生物，來源于自體全血，具有能緩慢釋放多種復合比例的生長因子、價格低廉、應用方便、可作為支架材料等特點且已被大量用于臨床和實驗的研究。我們了解到，通過將體外培養(yǎng)的細胞接種于特定的生物支架材料，然后進行體內(nèi)移植達到組織再生修復的傳統(tǒng)方法，存在細胞量的流失以及移植區(qū)的炎癥反應等問題；而細胞膜片技術(shù)的研發(fā)為這些問題的解決開辟了新的途徑，它不僅能夠保留大量的細胞，而且能夠儲存豐富的細胞外基質(zhì)及減輕移植區(qū)術(shù)后的炎癥反應，故在組織工程中具有廣闊的應用前景。然而，諸多研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)體外靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)所形成的組織工程軟骨在行使正常功能方面尚存在不足，并且壓力作為軟骨發(fā)生、發(fā)育及改建中的重要因素以及在軟骨再生中的作用已逐漸被關(guān)注和重視，但是目前大多數(shù)關(guān)于軟骨組織工程的研究卻熱衷于干細胞生長與分化的化學以及生長因子環(huán)境的調(diào)控方面的研究，而對干細胞在力學環(huán)境調(diào)控下成軟骨的效應研究卻較少見報道。因此，本實驗通過采用成體干細胞膜片與同體PRF膜復合構(gòu)建一種新型的組織工程移植物，采用可控細胞液壓加載裝置對其施以靜態(tài)壓力刺激以模擬細胞在體時的關(guān)節(jié)內(nèi)力學微環(huán)境，探究壓力調(diào)控對成體干細胞復合PRF雙膜復合體體外成軟骨能力的影響，并比較BMSCs和ADSCs兩種干細胞的體外成軟骨效應，為提高組織工程軟骨的質(zhì)和量提供新的研究思路以及為軟骨組織工程篩選優(yōu)質(zhì)的種子細胞以用于臨床軟骨再生修復提供實驗理論依據(jù)。 本實驗分為4個部分。第一部分為兔BMSCs膜復合同體PRF雙膜結(jié)構(gòu)復合體的構(gòu)建與鑒定。雄性新西蘭大白兔2只，3-4月齡，采用密度梯度離心法培養(yǎng)兔的BMSCs，流式細胞儀行表面標記分子的檢測以及成骨及成脂誘導分化鑒定，膜片誘導液誘導成膜并將其制成膜片片段。取兔耳廓中動脈全血10ml，3000r/min，10min離心獲得PRF，將PRF壓制成膜并將其剪成顆粒，與BMSCs細胞膜片片段按一定的比例手動混勻，加入適量α-MEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4天后取材。掃描電鏡觀察雙膜復合體特點，結(jié)果顯示：BMSCs細胞通過伸出的偽足嵌入到PRF膜網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的方式使兩者能夠較好的結(jié)合，從而形成一個整體；MTT法檢測雙膜復合體中BMSCs增殖情況，結(jié)果顯示：在有PRF作用組的BMSCs細胞增殖速度明顯要強于無PRF組；ELISA法檢測雙膜復合體中PRF的生長因子釋放情況，結(jié)果顯示：各種生長因子隨著時間的延長，其濃度逐漸降低，但降低的速度較為緩慢。 在第一部分實驗的基礎上，我們進行了第二部分實驗即探究壓力對BMSCs/PRF雙膜復合體中BMSCs的增殖及軟骨向分化的影響。采用自行研制的液態(tài)靜壓加載裝置設定給予雙膜結(jié)構(gòu)不同程度的壓力刺激，在90KPa、120KPa、150KPa壓力條件下分別加載1h/d、6h/d，將雙膜復合體放置在加壓裝置內(nèi)分別靜置1h/d和6h/d為對照組，在連續(xù)加載的第2、4、6天終止培養(yǎng)、取材， Real-time PCR法檢測PCNA，Sox-9，Aggrecan，Col-II基因的表達水平。Real-time PCR結(jié)果顯示：實驗所設定的各組壓力刺激條件均可在BMSCs產(chǎn)生顯著的促增殖效應，其中以120KPa/1h/4d的壓力條件下PCNA基因表達水平最高。2d壓力刺激明顯上調(diào)Aggrecan水平，而對Sox-9與Col-II的表達無顯著作用；4d壓力刺激可同時促進Aggrecan、Sox-9與Col-IImRNA的合成，其中以120KPa、1h/d、持續(xù)4d的壓力條件下的成軟骨基因表達水平最高；6d壓力刺激下僅在90KPa、120KPa加壓1h時表現(xiàn)出對Col-II mRNA的促進作用。同時，各加壓組的基因表達量均在4d時達到高峰，在6d時則開始下降，相同的加壓組在1h與6h間并無顯著性差異。鑒于120KPa/1h/d持續(xù)4d的壓力刺激為最適壓力加載方式，，進一步觀察這種壓力刺激對BMSCs/PRF雙膜復合體超微結(jié)構(gòu)的影響。將BMSCs膜片隨機分為4組即：BMSCs細胞膜組、BMSCs/PRF雙膜組、BMSCs細胞膜+壓力組、BMSCs/PRF雙膜+壓力組，分別于4d后取材。壓力為120KPa/1h/d的壓力刺激，采用透射電鏡和掃描電鏡分別觀察在適宜的壓力刺激下雙膜復合體中BMSCs細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的改變及細胞膜片表面結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示：在壓力刺激組中BMSCs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈擴張狀態(tài)，其中BMSCs/PRF雙膜+壓力組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張程度最為顯著，而不加壓組的BMSCs細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均呈相對閉鎖狀態(tài)；同時，加壓組的BMSCs細胞膜片表面可見顆粒狀分泌物及網(wǎng)狀的膠原纖維分布，其中BMSCs/PRF雙膜+壓力組細胞膜片表面顆粒狀分泌物和膠原纖維最為顯著，而不加壓組的BMSCs細胞膜片表面較為光滑未見明顯分泌物和膠原纖維。 在第三部分實驗中，我們試圖利用來源更容易的兔ADSCs，構(gòu)建ADSCs/PRF雙膜復合體，觀察壓力調(diào)控對其成軟骨能力的影響并與BMSCs進行比較，探究ADSCs能否真正取代BMSCs用于組織工程軟骨的構(gòu)建。采用組織塊法培養(yǎng)兔的ADSCs，流式細胞儀行表面標記分子的檢測以及成骨及成脂誘導分化鑒定，膜片誘導液誘導成膜并將其剪成膜片片段。取兔耳廓中動脈全血10ml，3000r/min，10min離心獲得PRF，將PRF壓制成膜并剪成顆粒狀，鑒于BMSCs/PRF雙膜復合體的構(gòu)建方法構(gòu)建ADSCs/PRF雙膜復合體。將ADSCs細胞膜片隨機分為4組：ADSCs細胞膜組、ADSCs/PRF雙膜組、ADSCs細胞膜+壓力組、ADSCs/PRF雙膜+壓力組，壓力刺激為120KPa/1h/d，分別于4d后取材，采用透射電鏡觀察ADSCs超微結(jié)構(gòu)的變化，Real-time PCR檢測各組PCNA，Sox-9，Aggrecan，Col-II基因的表達水平。結(jié)果顯示：壓力刺激對各組ADSCs膜細胞內(nèi)部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并未產(chǎn)生明顯影響；基因檢測各組ADSCs的PCNA.、Aggrecan及Col-II的mRNA的表達均在2d時達到最高，各處理組間相比，在PCNA、Aggrecan及Col-II的表達上均無顯著性差異，僅在Sox-9的表達上，各實驗組的表達量均高于對照組即單純的ADSCs膜片組。將以上各基因表達結(jié)果與相應的BMSCs各組基因表達水平相比，結(jié)果顯示：BMSCs膜在有無壓力或PRF的作用下，其PCNA，Sox-9，Aggrecan，Col-II基因的mRNA表達量均要顯著高于相應的ADSCs膜組。 在前三部分實驗的基礎之上，實驗的第四部分為基于BMSCs/PRF雙膜復合體的組織工程軟骨的構(gòu)建及觀察壓力對構(gòu)建軟骨的影響。采用三層BMSCs細胞膜片疊加復合一層PRF膜形成一個組織團塊，并將組織團塊隨機分為4組即：BMSCs復合PRF團塊組、BMSCs復合PRF團塊+壓力刺激組、BMSCs復合PRF團塊+軟骨誘導組、BMSCs復合PRF團塊+軟骨誘導組+壓力刺激組，壓力刺激采用120KPa/1h/d，軟骨誘導為使用成軟骨誘導液培養(yǎng)組織團塊，分別于2周、4周后取材。運用組織學HE和甲苯暗藍染色法觀察團塊組織形態(tài)學的變化。結(jié)果顯示：經(jīng)過4周的培養(yǎng)，每天給予壓力刺激組的團塊表面均可見軟骨細胞和軟骨基質(zhì)分布，其中又以軟骨誘導和壓力刺激同時給予組的軟骨細胞和軟骨基質(zhì)分泌量最多，而僅培養(yǎng)2周的團塊均未見明顯的軟骨細胞和軟骨基質(zhì)形成。 實驗結(jié)論： 1.利用BMSCs細胞膜片片段按適宜比例復合自體PRF膜顆�？蓸�(gòu)建一種新型的組織工程移植物，這種移植物可以為BMSCs細胞的生長提供基質(zhì)和生長因子雙重支持的微環(huán)境，具有較好的生物學特性。 2.壓力刺激可明顯促進BMSCs/PRF雙膜復合體中BMSCs的增殖與軟骨向分化能力，以120KPa每天靜壓1h連續(xù)4天的刺激對BMSCs增殖和成軟骨分化的促進作用最強，為BMSCs/PRF雙膜復合體體外成軟骨分化的最適壓力加載方式，在此壓力刺激下，可通過刺激細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴張，激活相關(guān)細胞器，從而促進蛋白及多糖類大分子物質(zhì)的合成，而無壓力作用組卻無此現(xiàn)象。 3.相同的壓力作用對ADSCs膜復合同體PRF膜雙膜復合體的增殖和成軟骨能力的作用不及相應的BMSCs顯著，相同的培養(yǎng)環(huán)境下，BMSCs膜的體外成軟骨能力明顯強于ADSCs。 4.利用三層BMSCs細胞膜片復合同體PRF膜的復合體，每天120KPa/1h的壓力刺激或提供成軟骨誘導的培養(yǎng)環(huán)境，4周后可見軟骨團塊形成，單純的壓力刺激可以取代成軟骨誘導液的作用；但如果在軟骨誘導的同時給予適宜的壓力刺激則可提高組織工程軟骨的質(zhì)量，而如果既不給予壓力加載又無軟骨誘導的環(huán)境下，BMSCs/PRF雙膜復合體體外培養(yǎng)4周并不能形成軟骨團塊。
【關(guān)鍵詞】：壓力 骨髓間充質(zhì)干細胞 脂肪干細胞 富血小板纖維蛋白 成軟骨
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-17
• 前言17-19
• 文獻回顧19-30
• 實驗一 BMSCS 復合 PRF 雙膜復合體的構(gòu)建及鑒定30-42
• 1 材料30-31
• 1.1 主要實驗試劑與儀器30-31
• 1.2 實驗動物31
• 2 方法31-35
• 2.1 兔 BMSCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定31-32
• 2.2 兔 BMSCs 復合 PRF 雙膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建32-33
• 2.3 雙膜復合體的鑒定33-35
• 2.4 統(tǒng)計學分析35
• 3 結(jié)果35-40
• 4 討論40-42
• 實驗二 壓力調(diào)控雙膜復合體中 BMSCS 的增殖與成軟骨能力的研究42-54
• 1 材料42-43
• 1.1 主要實驗試劑與儀器42
• 1.2 實驗動物42-43
• 2 方法43-46
• 2.1 兔 BMSCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定43
• 2.2 BMSCs 復合 PRF 雙膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建43
• 2.3 壓力對雙膜復合體中 BMSCs 增殖及成軟骨基因表達的觀察43-45
• 2.4 壓力調(diào)控 BMSCs/PRF 雙膜復合體的超微結(jié)構(gòu)觀察45-46
• 2.5 統(tǒng)計學分析46
• 3 結(jié)果46-52
• 4 討論52-54
• 實驗三 ADSCS/PRF 雙膜復合體的構(gòu)建及壓力對其影響的研究54-68
• 1 材料54-55
• 1.1 主要實驗試劑與儀器54
• 1.2 實驗動物54-55
• 2 方法55-58
• 2.1 兔 ADSCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定55-56
• 2.2 兔 ADSCs 復合 PRF 雙膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建56
• 2.3 壓力對 ADSCs/PRF 雙膜復合體中 ADSCs 超微結(jié)構(gòu)影響的觀察56-57
• 2.4 壓力對 ADSCs/PRF 中 ADSCs 增殖及成軟骨相關(guān)基因表達影響的觀察57
• 2.5 相同壓力微環(huán)境對兩種雙膜復合體中 BMSCs 和 ADSCs 增殖分化影響的比較57
• 2.6 統(tǒng)計學分析57-58
• 3 結(jié)果58-66
• 4 討論66-68
• 實驗四 基于 BMSCS/PRF 雙膜復合體的組織工程軟骨構(gòu)建及壓力對其影響的研究68-79
• 1 材料68
• 1.1 主要實驗試劑與儀器68
• 1.2 實驗動物68
• 2 方法68-71
• 2.1 兔 BMSCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定68-69
• 2.2 兔 BMSCs 細胞膜片的制備69
• 2.3 同體 PRF 膜的制備69
• 2.4 同體 BMSCs 膜復合 PRF 膜構(gòu)建組織工程軟骨69
• 2.5 取材與樣本處理69-71
• 2.6 統(tǒng)計學分析71
• 3 結(jié)果71-77
• 4 討論77-79
• 小結(jié)79-82
• 參考文獻82-95

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 張森林;毛天球;;應用富血小板血漿和骨髓基質(zhì)細胞構(gòu)建細胞-膜片及其異位成骨的實驗研究[J];臨床口腔醫(yī)學雜志;2009年03期

2 馬東洋;馬敬;姜東紅;王劍鋒;;骨髓間充質(zhì)干細胞膜片復合磷酸三鈣陶瓷構(gòu)建工程化骨組織的體內(nèi)成骨研究[J];中國美容醫(yī)學;2011年03期

3 張蓉;鄧煒焯;郭增良;高瞻;;骨髓間充質(zhì)干細胞膜片的體外構(gòu)建及成骨分化實驗研究[J];中國美容醫(yī)學;2012年13期

4 楊東翔;元香南;孔戰(zhàn);陳旭;張傳輝;李建軍;;組織工程軟骨的研究現(xiàn)狀與進展[J];山東醫(yī)藥;2011年40期

5 程杰平,馬洪順,褚懷德;骨性關(guān)節(jié)炎對膝關(guān)節(jié)軟骨力學性質(zhì)影響的實驗研究[J];醫(yī)用生物力學;2005年01期

6 王兆杰;安榮澤;于立志;張強;齊新文;楊晉;;軟骨脫細胞基質(zhì)復合脂肪源性干細胞構(gòu)建軟骨組織的實驗研究[J];中國矯形外科雜志;2009年06期

本文編號：801981