本文關(guān)鍵詞：表面微弧氧化涂層鎂合金ZK60的體外生物學(xué)性能研究

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【摘要】：研究背景 目前骨科臨床上常用的內(nèi)固定材料主要為傳統(tǒng)金屬,這些材料最大的弊端是需二次手術(shù)取出。此外,傳統(tǒng)金屬與骨組織的力學(xué)性能不匹配,易產(chǎn)生“應(yīng)力遮擋效應(yīng)”,導(dǎo)致骨不連或再次骨折等并發(fā)癥。生物可降解高分子材料作為上述金屬材料的替代物,雖然可避免二次手術(shù),但同時(shí)也存在一些問題,如體內(nèi)降解速度過快或過慢、機(jī)械強(qiáng)度不足、生物相容性不佳、易導(dǎo)致組織炎癥等。 鎂合金是一種新型的生物可降解金屬材料,具有較高的比強(qiáng)度和比剛度,適宜的密度及力學(xué)性能,能有效緩解應(yīng)力遮擋效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),近年來引起人們廣泛的關(guān)注。但鎂的耐蝕性差,植入體內(nèi)降解速度過快,難以達(dá)到固定效果,并在腐蝕過程中產(chǎn)生大量的氫氣,導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到限制。表面改性可顯著提高鎂合金的耐蝕性能,是目前醫(yī)用鎂合金應(yīng)用研究的重點(diǎn)。微弧氧化(micro-arc oxidation, MAO)是一種新興的表面改性技術(shù),與其它技術(shù)相比,它具有成本低、工藝簡單、涂層與基體結(jié)合牢固、結(jié)構(gòu)致密,良好的耐磨性及耐蝕性等優(yōu)點(diǎn),目前已在鎂合金表面改性中得到廣泛應(yīng)用。 中科院金屬研究所制備了表面MAO涂層鎂合金ZK60,并已通過體外實(shí)驗(yàn)證明了其良好的耐蝕性能。但作為一種新型的醫(yī)用可降解金屬材料,其具體的生物學(xué)性能如何尚不清楚。 研究目的 體外條件下觀察表面MAO涂層鎂合金ZK60對(duì)細(xì)胞增殖、黏附、成骨礦化及溶血的影響,初步評(píng)價(jià)材料的生物相容性及生物活性,驗(yàn)證其作為一種新型醫(yī)用可降解金屬材料的安全性及有效性,為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。 研究方法 1.材料的表性及生物相容性 通過掃描電鏡觀察MAO涂層的表面形貌,并用能譜分析儀及x線衍射儀檢測涂層的元素組成及化學(xué)成分。采用間接接觸法和直接接觸法進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為裸鎂合金組、涂層組、鈦合金組及空白對(duì)照組,按照IS010993-12標(biāo)準(zhǔn)(試樣表面積／浸體介質(zhì)=1.25cm2/ml)分別制備材料浸提液并培養(yǎng)細(xì)胞,空白對(duì)照組采用含10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察浸提液中細(xì)胞形態(tài),通過檢測細(xì)胞外乳酸脫氫酶(LDH)活性來評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性,并用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力,掃描電鏡下觀察材料表面細(xì)胞黏附形態(tài),檢測材料表面的蛋白吸附能力,進(jìn)一步采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6'-diamidino-2-phenylindole, DAPI)和鈣黃綠素／乙錠均二聚物-1(calcein-AM/ethidium homodimer-1, calcein-AM/EthD-1)染色法觀察細(xì)胞的早期黏附和生長狀態(tài)。 2.成骨礦化實(shí)驗(yàn) 通過間接接觸法觀察材料對(duì)細(xì)胞成骨礦化功能的影響。實(shí)驗(yàn)分為裸鎂合金組、涂層組、鈦合金組和空白對(duì)照組。采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate, p-NPP)法檢測細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性,茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)形成并進(jìn)行定量分析,進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR, QRT-PCR)技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。 3.溶血實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為裸鎂合金組、涂層組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組,參照國家醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法GB/T16175-2008進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肉眼觀察材料的溶血作用,計(jì)算溶血率。 研究結(jié)果 1.材料的表性及生物相容性 1.1掃描電鏡下可見MAO涂層表面呈粗糙、多孔隙形態(tài),孔隙直徑約為1μm,周圍均勻分布有微裂隙；材料橫斷面觀察可見鎂合金基體表面形成一約20μm的保護(hù)性涂層,涂層結(jié)構(gòu)致密,與基體結(jié)合牢固；能譜分析結(jié)果顯示涂層的主要組成元素為Mg、0和Si,同時(shí)含少量的Zn、F和K；X線衍射儀檢測提示涂層的主要成分為硅酸鎂(Mg2SiO4)和氧化鎂(MgO)。 1.2顯微鏡下見各材料浸提液中細(xì)胞生長狀態(tài)良好,細(xì)胞貼壁生長,輪廓清晰,形態(tài)多呈長梭形,大多細(xì)胞間以偽足形成連接,細(xì)胞內(nèi)可見顆粒,未見明顯細(xì)胞裂解或死亡,細(xì)胞形態(tài)毒性反應(yīng)分級(jí)為0級(jí)。 1.3各組的LDH活性分別為裸鎂合金組(1101.5±165.2)U/L、涂層組(1195±123.5)U/L、鈦合金組(1126.5±158.5)U/L、空白對(duì)照組(1158.5±90.3)U/L,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 1.4細(xì)胞增殖活力檢測提示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,各組OD值逐漸升高,不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在浸提液培養(yǎng)細(xì)胞的第1汞,裸鎂合金組及涂層組的OD值低于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),相對(duì)增殖率分別為90%和87%,細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)為1級(jí)；而在第3天和第5天,各組間OD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),實(shí)驗(yàn)材料組的細(xì)胞相對(duì)增殖率均為100%左右,毒性評(píng)價(jià)為0級(jí)。 1.5掃描電鏡下可見涂層組和鈦合金組材料表面細(xì)胞密集,而裸鎂合金表面細(xì)胞數(shù)量較少；涂層組細(xì)胞為長梭形或多角形,形態(tài)飽滿,細(xì)胞伸展性良好并通過偽足形成連接,與鈦合金組相比,細(xì)胞形態(tài)更佳、粘附更緊密,而裸鎂合金組材料表面細(xì)胞呈梭形,形態(tài)欠飽滿,伸展性較差。 1.6涂層組材料表面的蛋白吸附量為152.7±6.3(μg/ml),明顯高于裸鎂合金組和鈦合金組的96.3±3.9(μg/ml)和96.1±8.7(μh/ml),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而裸鎂合金組與鈦合金組間比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。1.7DAPI染色示隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,各組材料表面細(xì)胞黏附數(shù)量逐漸升高,不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),涂層組鎂合金材料表面的細(xì)胞黏附數(shù)明顯高于裸鎂合金組和鈦合金組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；在60min,裸鎂合金組和鈦合金組之間的細(xì)胞黏附數(shù)量無明顯差異(P0.05),而在30min和120min,裸鎂合金組的細(xì)胞黏附數(shù)低于鈦合金組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 1.8材料表面活／死細(xì)胞染色見裸鎂合金組材料表面細(xì)胞數(shù)量少,大多呈圓形,細(xì)胞形態(tài)較差；而涂層組和鈦合金組大多為綠染細(xì)胞,形態(tài)良好,伸出偽足粘附于材料表面,且在涂層組表面細(xì)胞顯得更飽滿,伸展性更佳。 2.成骨礦化實(shí)驗(yàn) 2.1各組間細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量無明顯差異(P0.05),而涂層組與裸鎂合金組中的ALP表達(dá)活性明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組(P0.01),且涂層組的ALP活性較裸鎂合金組更高(P0.01)。 2.2礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色見各組板孔內(nèi)呈不同程度的深紅色,其中涂層組染色最深,面積最廣,其次為裸鎂合金組,鈦合金組與空白對(duì)照組相比外觀無明顯差異；進(jìn)一步定量分析顯示裸鎂合金組和涂層組OD值分別為0.218±0.008和0.299±0.036,明顯高于鈦合金組及空白對(duì)照組的0.109±0.001和0.112±0.006,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；其中,涂層組高于裸鎂合金組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),鈦合金組與空白對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。細(xì)胞的成骨礦化程度依次為：涂層組裸鎂合金組鈦合金組／空白對(duì)照組。 2.3成骨相關(guān)基因的表達(dá)量檢測結(jié)果提示鈦合金組和空白對(duì)照組ALP、OPN、OCN和COⅠ四種基因的表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；裸鎂合金組和涂層組的ALP基因相對(duì)表達(dá)量分別為2.155±0.339和3.990±0.181,明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且涂層組高于裸鎂合金組(P0.05),結(jié)果與上文ALP活性檢測一致；裸鎂合金組和涂層組的OPN基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.799±0.066和1.838±0.038,明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而裸鎂合金組與涂層組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);OCN和COⅠ基因相對(duì)表達(dá)量裸鎂合金組和涂層組均明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且涂層組表達(dá)量較裸鎂合金組更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.溶血實(shí)驗(yàn) 肉眼下可見涂層組離心管中上清液呈無色透明,與陰性對(duì)照組管中的上清液顏色幾乎一樣,未見明顯溶血現(xiàn)象；裸鎂合金組的上清液呈淡紅色,有較明顯的溶血現(xiàn)象；陽性對(duì)照組管中上清液呈玫瑰紅色,紅細(xì)胞完全破裂溶解。實(shí)驗(yàn)材料中裸鎂合金組的溶血率為28.7%,明顯高于國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(5%),涂層組的溶血率僅為1.04%,且其OD值與陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),符合溶血標(biāo)準(zhǔn),不會(huì)引起明顯溶血反應(yīng)。 結(jié)論 1.MAO涂層技術(shù)可在鎂合金表面形成粗糙、多孔隙的表面形態(tài)； 2.鎂合金ZK60及其MAO涂層材料均可通過細(xì)胞毒性評(píng)價(jià),且鎂合金表面經(jīng)MAO涂層處理后,對(duì)細(xì)胞的親和力明顯改善,促進(jìn)細(xì)胞粘附生長,表現(xiàn)出良好的生物相容性； 3.鎂合金ZK60及其MAO涂層材料能促進(jìn)細(xì)胞成骨分化、礦化及成骨相關(guān)基因表達(dá),顯示出良好的骨誘導(dǎo)活性,且涂層材料的活性更高,這可能與涂層中硅酸鹽的釋放有關(guān)； 4.裸鎂合金ZK60具有一定的溶血作用,但表面經(jīng)MAO涂層處理后溶血率可符合生物材料的要求,有良好的血液相容性； 5.MAO涂層技術(shù)能明顯改善鎂合金的生物相容性及生物活性,是一種較理想的鎂合金表面改性方法； 6.本課題未對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的體內(nèi)降解特性及生物相容性進(jìn)行研究,因此表面MAO涂層鎂合金ZK60能否成為一種新型骨科內(nèi)植材料有待后期進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：生物可降解 鎂合金 表面改性 微弧氧化 生物相容性 生物活性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-23
• 第一章 鎂合金涂層的表性及細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)23-47
• 1 引言23
• 2 研究內(nèi)容23-24
• 3 材料與方法24-28
• 4 結(jié)果28-38
• 5 討論38-43
• 6 小結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 第二章 成骨礦化實(shí)驗(yàn)47-68
• 1 引言47-48
• 2 研究內(nèi)容48
• 3 材料和方法48-53
• 4 結(jié)果53-61
• 5 討論61-64
• 6.小結(jié)64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 第三章 溶血實(shí)驗(yàn)68-75
• 1 引言68
• 2 研究內(nèi)容68
• 3 材料與方法68-70
• 4 結(jié)果70-71
• 5 討論71-73
• 6.小結(jié)73
• 參考文獻(xiàn)73-75
• 全文小結(jié)75-76
• 碩士期間發(fā)表的論文76-77
• 致謝77-78

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本文編號(hào)：723245