本文關(guān)鍵詞：納米氧化鋯骨組織工程支架干細(xì)胞附著成骨研究

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【摘要】：研究背景： 外傷、感染、先天畸形、腫瘤外科手術(shù)等引起的頜面部骨組織缺損是口腔頜面部常見疾病,不僅會造成患者咀嚼、吞咽、語言等口腔功能障礙,還因嚴(yán)重的顏面部畸形,對患者精神、心理產(chǎn)生極大的危害。據(jù)報(bào)道,頜面部大面積骨組織缺損患者中,有90%者會產(chǎn)生自殺傾向�？梢娡晟频目谇活M面部骨組織缺損治療對患者身心具有重要意義。 骨移植術(shù)是治療骨缺損的傳統(tǒng)手段,其中自體骨移植一直被認(rèn)為是治療骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”,具有較高的治愈率。然而,自體骨移植存在骨來源量有限以及造成供骨區(qū)二次損害的缺陷。異體骨移植方法盡管避免了對患者供區(qū)部位的損害,但又帶來了感染率高及免疫排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)。骨組織工程運(yùn)用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理與技術(shù),在體外模擬人骨構(gòu)建三維多孔支架材料并誘導(dǎo)種子細(xì)胞在支架上生長、成骨,在解決口腔頜面部骨組織缺損中顯示出很好的發(fā)展前景。 骨組織工程原理包括支架材料、種子細(xì)胞和成骨因子三個方面。理想的支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性、可塑性,足夠的機(jī)械強(qiáng)度,應(yīng)滿足一定的孔隙結(jié)構(gòu)。良好的生物相容性是保證支架材料能夠作為細(xì)胞生長載體及植入機(jī)體內(nèi)應(yīng)用的前提,材料本身及其降解產(chǎn)物必須對機(jī)體安全,不引起任何炎癥和毒性反應(yīng)。良好的可塑性是指材料能夠按照骨缺損形狀、大小成型。足夠的機(jī)械強(qiáng)度保證了骨缺損修復(fù)前支架能夠起到支撐作用,維持骨的生理運(yùn)動。 目前,用于骨組織工程的支架材料主要分為兩大類,即生物衍生材料和人工合成材料。前者主要有天然骨、珊瑚骨、天然高分子聚合物(膠原、纖維蛋白)等。此類材料由于具有與天然骨相似的骨架結(jié)構(gòu)、利于成骨細(xì)胞粘附生長,具有一定的骨傳導(dǎo)作用。但是,天然骨存在免疫原性問題,珊瑚骨不易加工成型,天然高分子聚合物降解速度難以控制,并且他們均具有機(jī)械強(qiáng)度不足的缺陷。 人工合成材料致力于模擬天然骨形成機(jī)制,制備出仿生徑向梯度分布、具生物活性且多孔的細(xì)胞支架材料,成為組織工程骨材料的研究熱點(diǎn)。目前,人工合成材料大體上分為有機(jī)高分子材料、無機(jī)生物陶瓷材料以及多種復(fù)合材料。各種材料雖然各有優(yōu)點(diǎn),但是也因各自固有的缺點(diǎn)而未能廣泛應(yīng)用。聚酯類有機(jī)材料容易塑形,可降解性好,然而其降解產(chǎn)物呈酸性,對體內(nèi)微環(huán)境有影響,限制了實(shí)際的應(yīng)用。因良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性而成為目前應(yīng)用較多的骨替代品羥基磷灰石、磷酸三鈣等無機(jī)生物陶瓷類材料,也存在脆性較大、柔韌性不夠、不易加工成型的缺點(diǎn)。人們迫切尋求一種機(jī)械性能更加優(yōu)越的生物支架材料。 氧化鋯陶瓷材料的化學(xué)性能穩(wěn)定,機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)越,自上世紀(jì)60年代開始被用作生物材料。其壓縮強(qiáng)度及三點(diǎn)彎曲強(qiáng)度可分別達(dá)到2000和900MPa。長期的研究表明,氧化鋯陶瓷對細(xì)胞、肌肉、口腔粘膜及骨組織沒有任何毒性作用,并且與已廣泛應(yīng)用的骨折固定材料鈦金屬相比,其生物相容性更好,表面細(xì)菌粘附及增殖率更低。作為表面涂層能夠明顯地增強(qiáng)鈦合金(Ti-6A1-4V)的表面活性,增強(qiáng)牙科種植體的骨結(jié)合作用。氧化鋯陶瓷良好的生物相容性不斷得到醫(yī)學(xué)界認(rèn)可,被廣泛應(yīng)用于牙科全瓷修復(fù)、人體硬組織替代材料,以及其他生物材料的增韌成分。將氧化鋯陶瓷引入骨組織工程,構(gòu)造三維聯(lián)通多孔支架,在機(jī)械性能上表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。 1970年,Friedenstein等研究發(fā)現(xiàn)骨髓中存在一種具有很高的增殖與分化潛能,并有成骨能力的成纖維細(xì)胞樣集落形成單位(CFU-F)。緊接著研究發(fā)現(xiàn)CFU-F還具有向多種骨髓組織細(xì)胞分化的潛能,于是學(xué)者們提出了間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的概念。 在特定條件下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向成骨、成軟骨、成纖維、成脂肪、成肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等方向分化。其中,在添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸的條件培養(yǎng)基中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化,并表現(xiàn)出成骨特性。有學(xué)者比較誘導(dǎo)劑添加量對其成骨性的影響發(fā)現(xiàn),地塞米松10"8mol/L,β-甘油磷酸鈉1Ommol/L,抗壞血酸50μmol/L條件下,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率較高。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可通過抽取少量骨髓培養(yǎng)獲得,獲取方式容易,并可多次抽取,體外培養(yǎng)可多次傳代,確保足夠的細(xì)胞量。目前運(yùn)用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架材料研究最為廣泛。 因而,我們希望結(jié)合納米氧化鋯優(yōu)越的機(jī)械性能和良好的生物相容性,構(gòu)建三維聯(lián)通多孔骨組織工程支架,探索該支架的成型方法及其理化性能,在體外接種犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,評價(jià)其作為細(xì)胞載體,供干細(xì)胞附著、生長及成骨情況,進(jìn)而評價(jià)其構(gòu)建組織工程骨的可行性。 目的： 探索不同孔隙率納米氧化鋯多孔骨組織工程支架的成型方法及其理化性能,建立體外分離、培養(yǎng)和鑒定犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法體系,接種犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于納米氧化鋯多孔支架,并植入beagle犬體內(nèi),評價(jià)該支架作為細(xì)胞載體,供干細(xì)胞附著、生長及成骨情況,進(jìn)而評價(jià)其構(gòu)建組織工程骨的可行性。 方法： 1.不同孔隙率納米氧化鋯多孔陶瓷支架的成型及性能研究 60ppi聚氨酯為成型模板,納米級氧化鋯粉體為初始原料,運(yùn)用模板復(fù)制法,經(jīng)1、3、5、7次循環(huán)浸漬次數(shù)成型不同孔隙率納米氧化鋯多孔坯體,高溫?zé)Y(jié)后成型多孔支架。SEM及顯微CT測定其孔隙率,萬能試驗(yàn)機(jī)測試其壓縮強(qiáng)度,探索成型循環(huán)次數(shù)與所得支架孔隙結(jié)構(gòu)及機(jī)械強(qiáng)度的關(guān)系。溶血實(shí)驗(yàn)評價(jià)研究制備的納米氧化鋯多孔支架的生物安全性。 2.建立犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)和鑒定的方法體系 全麻下抽取犬髂前上棘全骨髓,全骨髓貼壁分離法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),置于37℃C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增。倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長形態(tài)；計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞生長增殖曲線；取生長狀態(tài)良好的第三代細(xì)胞,添加成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；堿性磷酸酶染色與茜素紅染色以鑒定其成骨細(xì)胞向分化能力。 3.犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞附著納米氧化鋯骨組織工程支架生長及成骨研究 支架經(jīng)表面處理后接種犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng),SEM觀察細(xì)胞在支架上早期附著情況,MTT法測定支架上細(xì)胞第1、3、6、9、12天增殖情況,PNPP偶氮法測定支架上細(xì)胞第1、3、5、7、14天的堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)水平,初步評價(jià)其構(gòu)建組織工程骨的可行性。另外,通過比較不同孔隙率支架上BMSCs附著、生長及成骨分化情況,結(jié)合支架壓縮強(qiáng)度以期篩選出既利于細(xì)胞生長又具高強(qiáng)度的納米氧化鋯骨組織工程支架。最后,通過建立犬下頜骨缺損模型,將篩選出的支架接種犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入犬下頜骨缺損處,觀察其體內(nèi)成骨情況。 結(jié)果： 1.不同孔隙率納米氧化鋯多孔支架性能研究。不同孔隙結(jié)構(gòu)的聚氨酯模板能夠獲得不同孔徑及孔隙率的納米氧化鋯多孔支架。60ppi聚氨酯模板經(jīng)多次成型循環(huán)能夠獲得不同孔隙率支架,并且隨循環(huán)次數(shù)增多,孔隙率逐漸降低,經(jīng)1、3、5、7次成型循環(huán)后其孔隙率分別為92.667%、85.913%、75.228%、67.983%；隨著孔隙率的降低,其壓縮強(qiáng)度逐漸增高,其結(jié)果依次為0.62MPa、0.83MPa、2.62MPa、4.38MPa。研究制備的納米氧化鋯多孔支架的溶血率為2.19%,小于5%,按照《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T0127.1-9》標(biāo)準(zhǔn),符合生物材料安全標(biāo)準(zhǔn),可用于生物實(shí)驗(yàn)。 2.犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定。原代細(xì)胞培養(yǎng)48h后首次換液可見少量細(xì)胞貼壁,呈梭形、三角形,血細(xì)胞及單核細(xì)胞因不能貼壁或貼壁能力不同,經(jīng)多次換液、傳代而逐漸去除。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致,螺旋狀生長,形成多個克隆單位,7-10天進(jìn)行首次傳代。傳代后細(xì)胞增殖活躍,平均3-4天可長滿瓶壁的90%。第三代細(xì)胞添加誘導(dǎo)劑后,細(xì)胞形態(tài)向多邊形轉(zhuǎn)換,培養(yǎng)10天,細(xì)胞行堿性磷酸酶染色呈陽性；21天茜素紅染色法染色鈣結(jié)節(jié)呈陽性。 3.不同孔隙率納米氧化鋯多孔支架上細(xì)胞生長及分化情況。其1、3、6、9、12天內(nèi)細(xì)胞增殖測試OD值分別為0.261,0.604,1.215,1.385,1.506；1、3、5、7、14天內(nèi)ALP表達(dá)水平測試OD值分別為0.016、0.020、0.023、0.032、0.062,與空白對照組支架檢測值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。比較不同孔隙率(92.667%、85.913%、75.228%、67.983%)支架對細(xì)胞附著生長的影響可見,孔隙率為75.228%支架組具有最高的細(xì)胞接種率及早期ALP水平,孔隙率為92.667%的支架細(xì)胞接種率最低。四組支架的細(xì)胞接種率依次為40.7%、58.14%、76.74%和61.63%。在后期的培養(yǎng)過程中,高孔隙率組支架(92.667%組)表現(xiàn)出更高的細(xì)胞增殖率及晚期ALP表達(dá)水平(P0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,接種有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的納米氧化鋯多孔支架表現(xiàn)出良好的成骨作用,支架與骨組織之間形成緊密的結(jié)合。 結(jié)論： 1.模板復(fù)制法成型的納米氧化鋯支架具有三維聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu),可以滿足細(xì)胞生長繁殖、代謝產(chǎn)物排泄、血液與組織液流通的需要。 2.研究制備的納米氧化鋯多孔支架符合生物材料的安全性標(biāo)準(zhǔn),支架孔隙、外形精確可控,機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)越,滿足體內(nèi)試驗(yàn)的強(qiáng)度要求。 3.研究制備的納米氧化鋯多孔支架具有作為組織工程支架聯(lián)合干細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨的可行性。犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在研究制備的納米氧化鋯多孔支架表面及內(nèi)部附著、生長并表達(dá)早期的成骨標(biāo)志,植入體內(nèi)后,表現(xiàn)出良好的骨缺損修復(fù)作用。
【關(guān)鍵詞】：納米氧化鋯 多孔支架 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨組織工程
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R783.1
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-18
• 第一章 不同孔隙率納米氧化鋯骨組織工程支架制備及性能研究18-26
• 1. 研究目的18
• 2. 材料和方法18-19
• 3. 結(jié)果19-23
• 4. 討論23-25
• 5. 結(jié)論25-26
• 第二章 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及成骨鑒定26-34
• 1. 研究目的26
• 2. 材料和方法26-29
• 3. 結(jié)果29-31
• 4. 討論31-33
• 5. 結(jié)論33-34
• 第三章 納米氧化鋯骨組織工程支架干細(xì)胞附著成骨研究34-45
• 1. 研究目的34
• 2. 材料和方法34-37
• 3. 結(jié)果37-42
• 4. 討論42-44
• 5. 結(jié)論44-45
• 全文總結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 文獻(xiàn)綜述49-57
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文57-59
• 致謝59-61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：708835