發(fā)布時(shí)間：2017-08-20 16:36

  本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及成骨成脂分化研究

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【摘要】：目的：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）是最常用的骨組織工程種子細(xì)胞。具有很強(qiáng)的增值能力,在一定的誘導(dǎo)條件下能夠分化為中胚層起源的組織,如骨、軟骨和脂肪等。為修復(fù)重建由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因形成的組織缺損,提供了理想的治療手段,是一項(xiàng)非常具有應(yīng)用前景的技術(shù)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是骨組織工程的良好載體，以其為載體攜帶目的基因神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor，NGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein,BMP2）移植進(jìn)入骨折大鼠模型以促進(jìn)骨折的愈合是課題《BMP2和NGF雙基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨折的實(shí)驗(yàn)研究》（項(xiàng)目編號(hào)81160223)的主要研究?jī)?nèi)容。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中含量極低，僅占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)0.001%-0.1%，體外培養(yǎng)難度較大。體外分離培養(yǎng)純度高、活力強(qiáng)、生物特性均一的BMSCs，對(duì)組織工程及細(xì)胞的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)顯得至關(guān)重要。建立一套簡(jiǎn)單易行有效的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、純化、鑒定的方案，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物鑒定及多向分化能力檢測(cè)。以期進(jìn)一步了解骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,為其應(yīng)用于臨床提供可靠的理論依據(jù)。 方法：將4周齡健康SD大鼠脫頸處死后，放入75%酒精浸泡約10分鐘，無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨，將股骨和脛骨表面肌肉及其他軟組織剝離干凈，PBS沖洗后，剪開(kāi)兩側(cè)骨端，用1ml注射器吸取DMEM低糖培養(yǎng)液，從長(zhǎng)骨一端插入注射器沖洗2次，將沖洗后的液體置于15ml無(wú)菌試管中，用3ml巴氏吸管適當(dāng)吹打骨髓細(xì)胞。將此懸液置入70mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)基（DMEM-LG培養(yǎng)液+15%胎牛血清+1%青鏈霉素）。放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。通過(guò)貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)并將細(xì)胞進(jìn)一步傳代純化，觀察其生長(zhǎng)特性。對(duì)細(xì)胞相關(guān)的性狀進(jìn)行觀察及分析。繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P7代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD45、CD90并作同型對(duì)照，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P5代細(xì)胞分別向成骨、成脂方向誘導(dǎo)分化并分別進(jìn)行茜素紅及油紅O染色，觀察誘導(dǎo)結(jié)果。 結(jié)果：經(jīng)該方法體外培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs呈集落狀貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)主要為成纖維樣細(xì)胞，顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，類(lèi)似漩渦狀、魚(yú)群狀或菊花瓣?duì)�。P1-P5代BMSCs增殖速度快，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定,生長(zhǎng)狀態(tài)較好。其后逐漸減慢，P10代之后細(xì)胞形態(tài)明顯老化，細(xì)胞邊緣粗糙，包體變大，形狀不規(guī)則。生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示骨髓基質(zhì)干細(xì)胞符合正常細(xì)胞生長(zhǎng)特征且生長(zhǎng)活躍。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定：BMSCs表達(dá)CD29和CD90，而不表達(dá)CD45，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞符合大鼠BMSCs的表型特征。將以成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行茜素紅染色后可見(jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)，而對(duì)照組未見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)。將以成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行油紅O染色后可見(jiàn)明顯的脂滴，而對(duì)照組不明顯。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs具有成骨和成脂分化的能力。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用的是一種相對(duì)簡(jiǎn)單易行的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離純化的方法，可獲得純度高，活性好，，性狀均一的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，可連續(xù)穩(wěn)定傳代10代以上。該法操作簡(jiǎn)單，可大量分離、純化、擴(kuò)增骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，所獲細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般生物學(xué)特性，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后具有多向分化潛能�？蔀榻M織工程提供充足的種子細(xì)胞來(lái)源，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【關(guān)鍵詞】：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 分離純化 培養(yǎng) 分化 鑒定
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 英漢縮略詞對(duì)照表11-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-22
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器14-16
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器14-15
• 1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑15
• 1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-22
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞取材16
• 1.2.2 大鼠 BMSCs 培養(yǎng)及傳代16-17
• 1.2.3 大鼠 BMSCs 細(xì)胞形態(tài)觀察17
• 1.2.4 大鼠 BMSCs 生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制（MTT 法）17-18
• 1.2.5 大鼠 BMSCs 流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型鑒定18
• 1.2.6 大鼠 BMSCs 成骨誘導(dǎo)18-20
• 1.2.6.1 成骨誘導(dǎo)試劑18-19
• 1.2.6.2 成骨誘導(dǎo)步驟19-20
• 1.2.7 大鼠 BMSCs 成脂誘導(dǎo)20-22
• 1.2.7.1 成脂誘導(dǎo)試劑20
• 1.2.7.2 成脂誘導(dǎo)步驟20-22
• 1.2.8 大鼠 BMSCs 的凍存22
• 2 結(jié)果22-28
• 2.1 大鼠 BMSCs 生長(zhǎng)及形態(tài)觀察22-24
• 2.2 MTT 法繪制大鼠 BMSCs 生長(zhǎng)曲線(xiàn)24-25
• 2.3 大鼠 BMSCs 流式細(xì)胞儀細(xì)胞 CD29、CD45、CD90 表型鑒定結(jié)果25-26
• 2.4 大鼠 BMSCs 成骨誘導(dǎo)結(jié)果26-27
• 2.5 大鼠 BMSCs 成脂誘導(dǎo)結(jié)果27-28
• 3 討論28-37
• 3.1 BMSCs 的發(fā)現(xiàn)28-29
• 3.2 BMSCs 的定義29
• 3.3 BMSCs 的體外分離與培養(yǎng)29-32
• 3.4 BMSCs 的鑒定32-35
• 3.4.1 BMSCs 的表型鑒定32-33
• 3.4.2 BMSCs 的多向分化潛能鑒定33-35
• 3.5 BMSCs 培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)35-37
• 4 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-44
• 綜述44-56
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 攻讀碩士學(xué)位期間科研成果目錄56-57
• 致謝57

本文編號(hào)：707741