本文關鍵詞：大鼠骨髓基質干細胞的培養(yǎng)及成骨成脂分化研究

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【摘要】：目的：骨髓基質干細胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）是最常用的骨組織工程種子細胞。具有很強的增值能力,在一定的誘導條件下能夠分化為中胚層起源的組織,如骨、軟骨和脂肪等。為修復重建由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因形成的組織缺損,提供了理想的治療手段,是一項非常具有應用前景的技術。骨髓基質干細胞是骨組織工程的良好載體，以其為載體攜帶目的基因神經生長因子（Nerve growth factor，NGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein,BMP2）移植進入骨折大鼠模型以促進骨折的愈合是課題《BMP2和NGF雙基因轉染骨髓基質干細胞移植治療骨折的實驗研究》（項目編號81160223)的主要研究內容。骨髓基質干細胞在骨髓中含量極低，僅占骨髓有核細胞總數(shù)0.001%-0.1%，體外培養(yǎng)難度較大。體外分離培養(yǎng)純度高、活力強、生物特性均一的BMSCs，對組織工程及細胞的體內、體外實驗顯得至關重要。建立一套簡單易行有效的骨髓基質干細胞的培養(yǎng)、純化、鑒定的方案，并進行細胞形態(tài)學觀察、表面標志物鑒定及多向分化能力檢測。以期進一步了解骨髓基質干細胞的生物學特性,為其應用于臨床提供可靠的理論依據(jù)。 方法：將4周齡健康SD大鼠脫頸處死后，放入75%酒精浸泡約10分鐘，無菌條件下取出股骨和脛骨，將股骨和脛骨表面肌肉及其他軟組織剝離干凈，PBS沖洗后，剪開兩側骨端，用1ml注射器吸取DMEM低糖培養(yǎng)液，從長骨一端插入注射器沖洗2次，將沖洗后的液體置于15ml無菌試管中，用3ml巴氏吸管適當吹打骨髓細胞。將此懸液置入70mm細胞培養(yǎng)皿內，加入適量完全培養(yǎng)基（DMEM-LG培養(yǎng)液+15%胎牛血清+1%青鏈霉素）。放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。通過貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)并將細胞進一步傳代純化，觀察其生長特性。對細胞相關的性狀進行觀察及分析。繪制生長曲線，將生長狀態(tài)良好的P7代細胞進行流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD29、CD45、CD90并作同型對照，取生長狀態(tài)良好的P5代細胞分別向成骨、成脂方向誘導分化并分別進行茜素紅及油紅O染色，觀察誘導結果。 結果：經該方法體外培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs呈集落狀貼壁生長，細胞形態(tài)主要為成纖維樣細胞，顯微鏡下觀察可見細胞成簇生長，類似漩渦狀、魚群狀或菊花瓣狀。P1-P5代BMSCs增殖速度快，細胞形態(tài)穩(wěn)定,生長狀態(tài)較好。其后逐漸減慢，P10代之后細胞形態(tài)明顯老化，細胞邊緣粗糙，包體變大，形狀不規(guī)則。生長曲線顯示骨髓基質干細胞符合正常細胞生長特征且生長活躍。用流式細胞儀進行細胞表型鑒定：BMSCs表達CD29和CD90，而不表達CD45，說明本實驗培養(yǎng)的細胞符合大鼠BMSCs的表型特征。將以成骨誘導液誘導培養(yǎng)的BMSCs進行茜素紅染色后可見明顯的鈣結節(jié)，而對照組未見鈣結節(jié)。將以成脂誘導液誘導培養(yǎng)的BMSCs進行油紅O染色后可見明顯的脂滴，而對照組不明顯。說明本實驗培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs具有成骨和成脂分化的能力。 結論：本實驗采用的是一種相對簡單易行的骨髓基質干細胞分離純化的方法，可獲得純度高，活性好，，性狀均一的骨髓基質干細胞。細胞生長旺盛，可連續(xù)穩(wěn)定傳代10代以上。該法操作簡單，可大量分離、純化、擴增骨髓基質干細胞，所獲細胞具有間充質干細胞的一般生物學特性，經誘導培養(yǎng)后具有多向分化潛能�？蔀榻M織工程提供充足的種子細胞來源，具有重要的現(xiàn)實意義。
【關鍵詞】：骨髓基質干細胞 分離純化 培養(yǎng) 分化 鑒定
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 英漢縮略詞對照表11-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-22
• 1.1 實驗材料與儀器14-16
• 1.1.1 實驗動物14
• 1.1.2 實驗儀器14-15
• 1.1.3 主要實驗試劑15
• 1.1.4 主要實驗材料15-16
• 1.2 實驗方法16-22
• 1.2.1 實驗細胞取材16
• 1.2.2 大鼠 BMSCs 培養(yǎng)及傳代16-17
• 1.2.3 大鼠 BMSCs 細胞形態(tài)觀察17
• 1.2.4 大鼠 BMSCs 生長曲線繪制（MTT 法）17-18
• 1.2.5 大鼠 BMSCs 流式細胞儀細胞表型鑒定18
• 1.2.6 大鼠 BMSCs 成骨誘導18-20
• 1.2.6.1 成骨誘導試劑18-19
• 1.2.6.2 成骨誘導步驟19-20
• 1.2.7 大鼠 BMSCs 成脂誘導20-22
• 1.2.7.1 成脂誘導試劑20
• 1.2.7.2 成脂誘導步驟20-22
• 1.2.8 大鼠 BMSCs 的凍存22
• 2 結果22-28
• 2.1 大鼠 BMSCs 生長及形態(tài)觀察22-24
• 2.2 MTT 法繪制大鼠 BMSCs 生長曲線24-25
• 2.3 大鼠 BMSCs 流式細胞儀細胞 CD29、CD45、CD90 表型鑒定結果25-26
• 2.4 大鼠 BMSCs 成骨誘導結果26-27
• 2.5 大鼠 BMSCs 成脂誘導結果27-28
• 3 討論28-37
• 3.1 BMSCs 的發(fā)現(xiàn)28-29
• 3.2 BMSCs 的定義29
• 3.3 BMSCs 的體外分離與培養(yǎng)29-32
• 3.4 BMSCs 的鑒定32-35
• 3.4.1 BMSCs 的表型鑒定32-33
• 3.4.2 BMSCs 的多向分化潛能鑒定33-35
• 3.5 BMSCs 培養(yǎng)經驗總結35-37
• 4 結論37-38
• 參考文獻38-44
• 綜述44-56
• 參考文獻51-56
• 攻讀碩士學位期間科研成果目錄56-57
• 致謝57

本文編號：707741