本文關(guān)鍵詞：組織工程化神經(jīng)導(dǎo)管對外周神經(jīng)修復(fù)的基礎(chǔ)應(yīng)用研究

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【摘要】：外周神經(jīng)缺損臨床上較常見,全世界每年約一百萬人發(fā)生周圍神經(jīng)損傷,該疾病嚴(yán)重影響患者的身心健康并造成其生活質(zhì)量的下降。近百年來,神經(jīng)缺損后的再生及最大限度的功能修復(fù)一直是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究的重點與亟待攻克的一大難題。自體神經(jīng)移植術(shù)作為神經(jīng)損傷修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,由于存在來源有限等局限性,嚴(yán)重制約了其在臨床的廣泛應(yīng)用。近年來,隨著組織工程學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步,為尋找理想的神經(jīng)再生替代品開辟了新的方向。本研究利用靜電紡絲技術(shù)制備膠原蛋白/PCL納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管殼層,采用特制模具制備復(fù)合紅景天苷微球的膠原蛋白多通道導(dǎo)管芯層,二者嵌套并1%京尼平交聯(lián),構(gòu)建一種新型的管中管結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管支架材料。運用材料性能評價方法對導(dǎo)管支架材料的理化性能和力學(xué)性能進(jìn)行分析。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)與復(fù)合紅景天苷微球的導(dǎo)管芯層材料復(fù)合培養(yǎng)不同時間。通過掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料的黏附情況;CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力;細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法檢測BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)的情況。復(fù)制Wistar大鼠坐骨神經(jīng)15 mm缺損動物模型,大鼠隨機(jī)分為5組,即空導(dǎo)管組,空白材料組,復(fù)合紅景天苷微球材料組,自體神經(jīng)組和神經(jīng)缺損組,每組12只。術(shù)后一個月、兩個月、三個月分別采集各組大鼠足跡并測量坐骨神經(jīng)功能指數(shù),采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。術(shù)后五個月,重新暴露神經(jīng)導(dǎo)管橋接處的坐骨神經(jīng),利用電生理儀檢測再生神經(jīng)的傳導(dǎo)功能;標(biāo)本取材后常規(guī)固定、切片,行組織學(xué)(HE)染色,S100,神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament,NF),神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)免疫組織化學(xué)染色,綜合評價神經(jīng)損傷修復(fù)和再生的效果。研究結(jié)果顯示,紅景天苷微球8 h時緩釋率達(dá)最高水平,約為23%,8~72 h微球的緩釋率略有降低且趨于平穩(wěn),其緩釋率為(20±1)%,載荷紅景天苷的微球具有良好的緩釋效果。神經(jīng)導(dǎo)管殼層交聯(lián)前后的表面接觸角分別為120°和0°,交聯(lián)后殼層支架材料具有極強(qiáng)的親水性;神經(jīng)導(dǎo)管殼層交聯(lián)前后的透氣率分別為(60.2±3.4)%和(71.1±5.1)%,其差異不顯著(P0.05);神經(jīng)導(dǎo)管殼層交聯(lián)前最大載荷為21.5~25.8 N,斷裂載荷為12.3~15.7 N,交聯(lián)后最大載荷為40.7~42.9 N,斷裂載荷為28.2~33.1 N,交聯(lián)前后差異顯著(P0.05),殼層具有一定的力學(xué)強(qiáng)度。交聯(lián)前后導(dǎo)管芯層的吸水率分別為(645±54)%和(764±88)%,兩者比較差異顯著(P0.05)。BMSCs在復(fù)合紅景天苷微球的膠原蛋白芯層上具有良好的黏附、生長和增殖能力,鬼筆環(huán)肽免疫熒光化學(xué)染色顯示可見神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)。S100免疫熒光化學(xué)染色顯示S100為陽性表達(dá),復(fù)合紅景天苷微球的芯層材料通過緩釋紅景天苷能誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。大鼠術(shù)后一個月,兩個月,三個月大鼠足跡及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)顯示,復(fù)合紅景天苷微球?qū)Ч芙M與自體神經(jīng)組相近,顯著高于其他組(P0.05)。電生理檢測結(jié)果表明,復(fù)合紅景天苷微球組與自體神經(jīng)組的潛伏期無顯著差別(P0.05),與其余各組大鼠潛伏期差異顯著(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示,復(fù)合紅景天苷微球材料組可見明顯的再生軸突,空導(dǎo)管組再生軸突不明顯。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,空導(dǎo)管組,空白材料組,復(fù)合紅景天苷微球材料組,自體神經(jīng)組S100、NF表達(dá)水平依次增強(qiáng);相反,GFAP蛋白的表達(dá)依次減弱。復(fù)合紅景天苷微球組修復(fù)效果明顯優(yōu)于空導(dǎo)管組,空白材料組,與自體神經(jīng)組修復(fù)效果相近。本實驗構(gòu)建的復(fù)合紅景天苷微球的膠原蛋白多通道神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的吸水性,透氣性,組織相容性及一定的力學(xué)性能,能有效促進(jìn)外周神經(jīng)損傷的修復(fù)和功能重建,與自體神經(jīng)移植效果相似,具有潛在的臨床價值和應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：膠原蛋白 紅景天苷 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 外周神經(jīng)損傷 組織工程 神經(jīng)導(dǎo)管
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R745;R318.08
【目錄】：

• 摘要2-4
• SUMMARY4-7
• 縮略詞表7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-21
• 1 外周神經(jīng)缺損的現(xiàn)狀12
• 2 神經(jīng)修復(fù)的研究發(fā)展12-18
• 2.1 顯微外科手術(shù)修復(fù)神經(jīng)缺損12-13
• 2.2 神經(jīng)移植術(shù)修復(fù)神經(jīng)缺損13
• 2.2.1 自體神經(jīng)移植術(shù)13
• 2.2.2 異體神經(jīng)移植術(shù)13
• 2.3 組織工程學(xué)修復(fù)神經(jīng)缺損13-18
• 2.3.1 生物材料支架14-15
• 2.3.2 種子細(xì)胞15-17
• 2.3.2.1 施旺細(xì)胞15-16
• 2.3.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞16
• 2.3.2.3 脂肪干細(xì)胞16-17
• 2.3.2.4 神經(jīng)干細(xì)胞17
• 2.3.2.5 胚胎干細(xì)胞17
• 2.3.3 輔助因子17-18
• 3. 神經(jīng)導(dǎo)管的發(fā)展進(jìn)程18-21
• 第二章 神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建與性能評價21-31
• 1 前言21-22
• 2 實驗材料22
• 2.1 實驗的主要試劑及主要溶液配制方法22
• 2.1.1 實驗的主要試劑22
• 2.1.2 主要溶液配制方法（見附錄二）22
• 2.2 主要儀器設(shè)備22
• 3 實驗方法22-26
• 3.1 神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建22-24
• 3.1.1 紅景天苷微球的制備22-23
• 3.1.2 神經(jīng)導(dǎo)管殼層的制備23
• 3.1.3 導(dǎo)管芯層的制備23
• 3.1.4 合成神經(jīng)導(dǎo)管并京尼平交聯(lián)23-24
• 3.2 神經(jīng)導(dǎo)管的性能評價24-25
• 3.2.1 紅景天苷微球緩釋的測定24-25
• 3.2.2 納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管殼層表面接觸角的測定25
• 3.2.3 納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管殼層力學(xué)性能測試25
• 3.2.4 納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管殼層透氣性的檢測25
• 3.2.5 導(dǎo)管芯層質(zhì)量吸水率的測定25
• 3.3 統(tǒng)計分析25-26
• 4 實驗結(jié)果26-29
• 4.1 掃描電鏡材料的表觀特征26-27
• 4.2 紅景天苷微球的緩釋效果27-28
• 4.3 納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管殼層的表面接觸角28
• 4.4 納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管殼層的力學(xué)性能28-29
• 4.5 納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管殼層的透氣性29
• 4.6 導(dǎo)管芯層質(zhì)量吸水率29
• 5 討論29-31
• 第三章 材料與大鼠BMSCS相互作用的研究31-42
• 1 前言31
• 2 實驗材料31-32
• 2.1 實驗動物31
• 2.2 實驗的主要試劑及主要溶液配制方法31-32
• 2.2.1 實驗的主要試劑31-32
• 2.2.2 主要溶液配制方法（見附錄二）32
• 2.3 主要儀器設(shè)備32
• 3 實驗方法32-36
• 3.1 材料的制備32
• 3.2 BMSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定32-33
• 3.3 BMSCs與材料的生物相容性33-36
• 3.3.1 細(xì)胞與材料的黏附性33
• 3.3.2 CCK-8 法測細(xì)胞在材料上的增殖33-34
• 3.3.3 細(xì)胞在材料上的生長及檢測34-36
• 3.4 統(tǒng)計分析36
• 4 實驗結(jié)果36-39
• 4.1 BMSCs的鑒定36-37
• 4.2 材料的表征及黏附性37-38
• 4.3 細(xì)胞在材料上的增殖38-39
• 4.4 神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá)39
• 5 討論39-42
• 第四章 復(fù)合紅景天苷微球神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損的初步研究42-56
• 1 前言42-43
• 2 實驗材料43-44
• 2.1 實驗動物43
• 2.2 實驗的主要試劑及主要溶液配制方法43
• 2.2.1 實驗的主要試劑43
• 2.2.2 主要溶液配制方法（見附錄二）43
• 2.3 主要儀器設(shè)備43-44
• 3 實驗方法44-46
• 3.1 手術(shù)操作過程（見圖 4-1）：44
• 3.2 大鼠足跡及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)的測定44-45
• 3.2.1 大鼠術(shù)后三個月采集大鼠的足跡44-45
• 3.2.2 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic functional index，SFI）測定45
• 3.3 電生理檢測45
• 3.4 組織學(xué)檢查45-46
• 3.5 統(tǒng)計分析46
• 4 實驗結(jié)果46-51
• 4.1 一般觀察46-47
• 4.2 大鼠足跡及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)的測定47-48
• 4.3 電生理檢測48-50
• 4.4 組織學(xué)檢查50-51
• 5 討論51-56
• 第五章 結(jié)論與展望56-58
• 1 結(jié)論56
• 2 不足與展望56-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 附錄一66-67
• 附錄二67-68
• 致謝68-69
• 作者簡介69-70
• 導(dǎo)師簡介70-72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：700953