本文關(guān)鍵詞：功能性自組裝多肽水凝膠負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療家兔后肢缺血

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【摘要】：目的：在應(yīng)用干細(xì)胞移植治療缺血性疾病中,改進(jìn)傳統(tǒng)的局部注射單純干細(xì)胞懸液或者動(dòng)脈腔內(nèi)注射干細(xì)胞等方法,使用功能性自組裝多肽水凝膠支架負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并移植到家兔后肢缺血模型,來觀察功能性自組裝多肽水凝膠負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植,相對(duì)于單純干細(xì)胞移植方案,是否達(dá)到更好的治療缺血性疾病的效果,從而為干細(xì)胞移植治療缺血性疾病做出新的探索。方法：使用膠原酶消化法從脂肪組織中提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,行原代培養(yǎng)并傳代擴(kuò)增,測(cè)試其生長(zhǎng)、增殖特性并對(duì)其進(jìn)行免疫表型、多向誘導(dǎo)分化鑒定,以證明其干細(xì)胞屬性。合成自組裝多肽分子RADA16-I和附加VEGF模擬片段的功能性多肽序列KLT,使用生物級(jí)無菌超純水溶解多肽粉末,并將RADA16-I多肽溶液和KLT多肽溶液以1：1的體積比例混合制備功能性自組裝多肽RADA/KLT,行超聲混勻、過濾滅菌后,行原子力顯微鏡檢測(cè)。將RADA/KLT多肽溶液加入24孔板中的transwell、室,使用PBS通過小室基底膜誘發(fā)多肽溶液自組裝成水凝膠,制備水凝膠樣本行掃描電鏡檢測(cè),而后使用培養(yǎng)基中和水凝膠內(nèi)的成份,來制備可以用來三維培養(yǎng)細(xì)胞的水凝膠,并將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種到不同培養(yǎng)條件的RADA16-I和RADA/KLT水凝膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)。使用AO/EB染色法觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在水凝膠中的存活情況,以此來探討細(xì)胞與水凝膠的相容性、安全性。制作家兔后肢缺血模型,并在術(shù)后對(duì)分組的家兔分別移植負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的功能性自組裝多肽水凝膠、單純脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液、PBS等,移植后觀察家兔后肢的一般狀況、脈搏、皮溫、血壓等,并行后肢數(shù)字減影動(dòng)脈造影術(shù),30d后取后肢肌肉標(biāo)本切片并行HE染色評(píng)估組織存活狀況并作評(píng)分,行血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色并計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞,行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析移植負(fù)載干細(xì)胞的功能性自組裝多肽水凝膠組是否達(dá)到更好的治療效果。結(jié)果：貼壁的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)了成纖維細(xì)胞樣形態(tài),并逐漸展現(xiàn)出了較高的增殖活性,其形態(tài)和增殖能力在傳代過程中可以維持,流式細(xì)胞術(shù)證明了其與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型相符,對(duì)其進(jìn)行的成骨、成脂誘導(dǎo)分化均成功。合成多肽并溶解混合后,行原子力顯微鏡檢測(cè)顯示了多肽的納米纖維樣結(jié)構(gòu),其納米纖維直徑、長(zhǎng)度均一,PBS成功誘發(fā)多肽溶液自組裝成水凝膠,水凝膠固態(tài)透明、無色、質(zhì)脆,且含水量極其豐富。掃描電鏡檢測(cè)水凝膠可見其內(nèi)部為孔隙樣結(jié)構(gòu),孔徑大小為10-50μm。對(duì)比脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件的兩種水凝膠中生長(zhǎng),可見含細(xì)胞因子培養(yǎng)基中和的功能性自組裝多肽水凝膠RADA/KLT中,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)最好,細(xì)胞伸展、遷移且互相連接,AO/EB染色可見細(xì)胞在水凝膠內(nèi)存活率很高。成功制作家兔后肢缺血模型后,家兔術(shù)側(cè)后肢迅速出現(xiàn)跛行、皮溫低、血壓測(cè)不出、無脈等,使用不同的細(xì)胞移植方法進(jìn)行治療30d后,通過一般情況評(píng)價(jià)、組織切片評(píng)分、血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法,證明了移植負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的功能性自組裝多肽水凝膠組較單純移植脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組對(duì)家兔后肢缺血有著更好的治療效果。結(jié)論：使用功能性自組裝多肽水凝膠負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞移植治療家兔后肢缺血,達(dá)到了較傳統(tǒng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液注射法更好的治療效果。
【關(guān)鍵詞】：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 自組裝多肽 水凝膠 細(xì)胞移植 缺血性疾病
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R543
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符號(hào)說明11-12
• 前言12-17
• 第一部分 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定17-28
• 材料與方法18-23
• 結(jié)果23-25
• 討論25-28
• 第二部分 功能性自組裝多肽水凝膠的構(gòu)建及體外復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)28-41
• 材料與方法30-34
• 結(jié)果34-36
• 討論36-41
• 第三部分 功能性自組裝多肽水凝膠負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療家兔后肢缺血模型及效果評(píng)價(jià)41-53
• 材料與方法43-47
• 結(jié)果47-49
• 討論49-53
• 結(jié)論53-54
• 附圖54-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄71-72
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表72

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本文編號(hào)：695699