本文關鍵詞：新型聚乙烯亞胺納米凝膠攜帶miRNA質粒抑制大鼠Kupffer細胞核因子κB的表達

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【摘要】：目的：研究新型聚乙烯亞胺納米凝膠(PEI-NP)攜帶小、RNA (miRNA)質粒沉默大鼠Kupffer細胞(KC)內核因子κB (NF-κB)的表達。方法：1.設定LPSNs與miRNA梯度質量比(30：1、25：1、20：1、15：1、10:1、5:1、2:1)37℃普通水平搖床混合30 min后,凝膠電泳檢測PEI-NP裝載miRNA質粒的容量；再以PEI-NP/miRNA質粒混合物轉染RAW264.7細胞后分別采用CCK-8法檢測細胞毒性,annexin V-FITC/PI孵育后再利用流式細胞儀檢測RAW264.7細胞凋亡。從而獲得LPSNs載荷質粒最適質量比。2.根據(jù)LPSNs最適載荷質粒的質量比,以PEI-NP/miRNA質�；旌衔镛D染RAW264.7細胞,分別在轉染細胞12h、24h和48h后采用流式細胞儀檢測轉染率,實時定量PCR (qRT-PCR)檢測RAW264.7細胞NF-κB mRNA水平,Western blot法檢測RAW264.7細胞NF-κB蛋白水平,從而獲得LPSNs介導miRNA質粒轉染體外巨噬細胞的效率。12只清潔級SD大鼠隨機分為轉染組和空載組,每組6只。以PEI-NP/miRNA質粒混合后,經(jīng)門靜脈微量泵入SD大鼠肝臟。6h后,每組取3只大鼠處死,取其肝臟進行透射電鏡觀察PEI-NP分布,剩余的SD大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)。48 h后取剩余大鼠肝臟,分別用qRT-PCR和Western blot檢測NF-KB P65 mRNA或蛋白的表達,免疫組織化學技術檢測rJF-kB P65在KC內的表達,從而獲得LPSNs介導miRNA質粒轉染體內KC的情況。結果：1.凝膠電泳測得PEI-NP/miRNA質粒質量比大于20：1時載荷率等于100%,兩者質量比小于5：1時載荷率等于0。CCK-8測得PEI-NP/miRNA質粒質量比=20：1刺激12h細胞活性為0.940±0.034,均比PEI-NP/miRNA=30:1細胞活性高(0.901±0.054)(P0.05)和PEI-NP/miRNA=25:1細胞活性(0.927+0.036) (P0.05)。在PEI-NP/ miRNA質粒不同質量比刺激細胞48 h內,細胞活性均大于90%。流式細胞儀測得PEI-NP/miRNA=30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的凋亡率分別為(9.00+0.28)%、(7.62+0.55)%、(7.32+0.23)%、(6.27+0.09)% 、 (5.90+0.21)%、(2.05+0.09)%, 其中PEI-NP/miRNA=20:1凋亡率,比PEI-NP/miRNA=30:1和 PEI-NP/miRNA=25:1低。2.流式細胞儀檢測12、24、48 h,轉染率分別為(1.76±0.28)%、(13.03±1.64)%、(33.47±2.01)%, 48h轉染率顯著高于24 h、12 h。與對照組相比,PEI-NP/miRNA轉染的RAW264.7細胞NF-κB蛋白含量顯著下降,透射電鏡觀察到RAW264.7細胞內有大量PEI-NP。肝臟組織透射電鏡只在KC內觀察到PEI-NP分布；免疫組織化學染色結果顯示,轉染組肝臟KC內NF-κB蛋白與空載組相比表達下降。結論：1.新型PEI-NP載荷外源基因的能力強,使實現(xiàn)高效轉染的設想成為可能。在PEI-NP/miRNA質粒不同質量比刺激細胞48 h內,細胞活性均大于90%,細胞毒性較小,滿足細胞轉染需求。細胞凋亡率隨PEI-NP濃度的增加而上升,與細胞毒性實驗結果相似。2. PEI-NP能攜帶miRNA質粒順利的進入體外巨噬細胞,并且在48 h時發(fā)揮的作用最明顯。PEI-NP攜帶niRNA質粒能成功轉染體內KC并沉默NF-κB的表達。
【關鍵詞】：聚乙烯亞胺納米凝膠 Kupffer細胞 microRNA 核因子κB
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-13
• 前言13-14
• 第一部分 LPSNs毒性與載荷率實驗14-21
• 1 材料與方法14-18
• 1.1 材料14-15
• 1.2 方法15-18
• 2 結果18-19
• 2.1 PEI-NP/miRNA質粒載荷率18-19
• 2.2 PEI-NP/miRNA質粒轉染RAW264.7細胞活性19
• 2.3 細胞凋亡率19
• 3 討論19-21
• 第二部分 LPSNs介導miRNA質粒轉KC的效率21-30
• 1 材料與方法21-27
• 1.1 材料21-23
• 1.2 方法23-27
• 2 結果27-28
• 2.1 RAW264.7細胞轉染率27-28
• 2.2 轉染RAW264.7細胞的形態(tài)特點和體外轉染效果28
• 2.3 體內轉染效果28
• 3 討論28-30
• 全文總結30-31
• 參考文獻31-34
• 實驗附圖34-40
• 文獻綜述40-49
• 參考文獻46-49
• 致謝49-50
• 在讀期間發(fā)表論文50

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1 沈敏;李俊杰;李霄;岳樹強;;丹參化學成分對脂多糖激活Kupffer細胞作用的影響[J];臨床肝膽病雜志;2012年11期

2 王志榮,韓德伍,馬學慧,趙元昌;Kupffer細胞對實驗性肝損傷脂質過氧化反應的影響[J];蚌埠醫(yī)學院學報;1997年05期

3 黃漢飛;曾仲;;Kupffer細胞在肝移植中的免疫作用[J];世界華人消化雜志;2009年02期

4 朱海軫,阮幼冰,武忠弼,ＳＩｖａｎｋｏｖｉｃ;Kupffer細胞在實驗性肝癌形成中的作用[J];中華病理學雜志;1998年02期

5 焦艷;唐娜;王嫦鶴;;白術多糖對小鼠Kupffer細胞免疫功能的激活作用[J];西北藥學雜志;2013年06期

6 王君,夏雪雁,彭仁t,陳效;當歸多糖對大鼠Kupffer細胞免疫功能的激活作用[J];藥學學報;2004年03期

7 劉廣健;呂明德;森安史典;謝曉燕;劉泳東;徐作峰;謝曉華;王竹;;大鼠Kupffer細胞內外Sonazoid微泡超聲輻照下的動態(tài)現(xiàn)象[J];中山大學學報(醫(yī)學科學版);2012年05期

8 羅殿中;李志尚;;慢性肝病時Kupffer細胞數(shù)量、形態(tài)及功能的改變[J];廣西醫(yī)學;1988年02期

9 許懷瑾;;多系統(tǒng)器官衰竭(內毒素激活Kupffer細胞致肝細胞蛋白合成改變)[J];國外醫(yī)學.外科學分冊;1985年04期

10 文春河,蘇冬梅,王喜愛;有機鍺對矽肺鼠血清超氧化物歧化酶、脂質過氧化水平及肝Kupffer細胞功能的影響[J];中國工業(yè)醫(yī)學雜志;2000年01期

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1 曾天舒;劉豐民;陳璐璐;;清除Kupffer細胞改善高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟胰島素抵抗[A];中華醫(yī)學會第十次全國內分泌學學術會議論文匯編[C];2011年

2 曾天舒;劉豐民;;Kupffer細胞在高脂誘導C57bl/6j小鼠胰島素抵抗中作用的研究[A];中華醫(yī)學會第十一次全國內分泌學學術會議論文匯編[C];2012年

3 丁虹;彭仁t;;Kupffer細胞對肝藥物代謝酶的調節(jié)作用[A];第七屆全國生化藥理學術討論會論文摘要集[C];2000年

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1 成名翔;NBD多肽抑制Kupffer細胞激活改善大鼠肝移植缺血再灌注損傷的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

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4 連崢嶸;HDAC11對脂多糖處理的Kupffer細胞免疫耐受誘導功能的影響及其機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

5 李偉;鼠重組IL-12腺病毒經(jīng)脂質體包埋轉染Kupffer細胞的實驗研究[D];蘇州大學;2006年

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本文編號：693014