本文關(guān)鍵詞：新型聚乙烯亞胺納米凝膠攜帶miRNA質(zhì)粒抑制大鼠Kupffer細(xì)胞核因子κB的表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 聚乙烯亞胺納米凝膠 Kupffer細(xì)胞 microRNA 核因子κB

【摘要】：目的：研究新型聚乙烯亞胺納米凝膠(PEI-NP)攜帶小、RNA (miRNA)質(zhì)粒沉默大鼠Kupffer細(xì)胞(KC)內(nèi)核因子κB (NF-κB)的表達(dá)。方法：1.設(shè)定LPSNs與miRNA梯度質(zhì)量比(30：1、25：1、20：1、15：1、10:1、5:1、2:1)37℃普通水平搖床混合30 min后,凝膠電泳檢測PEI-NP裝載miRNA質(zhì)粒的容量；再以PEI-NP/miRNA質(zhì)�；旌衔镛D(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后分別采用CCK-8法檢測細(xì)胞毒性,annexin V-FITC/PI孵育后再利用流式細(xì)胞儀檢測RAW264.7細(xì)胞凋亡。從而獲得LPSNs載荷質(zhì)粒最適質(zhì)量比。2.根據(jù)LPSNs最適載荷質(zhì)粒的質(zhì)量比,以PEI-NP/miRNA質(zhì)粒混合物轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,分別在轉(zhuǎn)染細(xì)胞12h、24h和48h后采用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率,實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)檢測RAW264.7細(xì)胞NF-κB mRNA水平,Western blot法檢測RAW264.7細(xì)胞NF-κB蛋白水平,從而獲得LPSNs介導(dǎo)miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外巨噬細(xì)胞的效率。12只清潔級SD大鼠隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組和空載組,每組6只。以PEI-NP/miRNA質(zhì)�；旌虾�,經(jīng)門靜脈微量泵入SD大鼠肝臟。6h后,每組取3只大鼠處死,取其肝臟進(jìn)行透射電鏡觀察PEI-NP分布,剩余的SD大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)。48 h后取剩余大鼠肝臟,分別用qRT-PCR和Western blot檢測NF-KB P65 mRNA或蛋白的表達(dá),免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測rJF-kB P65在KC內(nèi)的表達(dá),從而獲得LPSNs介導(dǎo)miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體內(nèi)KC的情況。結(jié)果：1.凝膠電泳測得PEI-NP/miRNA質(zhì)粒質(zhì)量比大于20：1時(shí)載荷率等于100%,兩者質(zhì)量比小于5：1時(shí)載荷率等于0。CCK-8測得PEI-NP/miRNA質(zhì)粒質(zhì)量比=20：1刺激12h細(xì)胞活性為0.940±0.034,均比PEI-NP/miRNA=30:1細(xì)胞活性高(0.901±0.054)(P0.05)和PEI-NP/miRNA=25:1細(xì)胞活性(0.927+0.036) (P0.05)。在PEI-NP/ miRNA質(zhì)粒不同質(zhì)量比刺激細(xì)胞48 h內(nèi),細(xì)胞活性均大于90%。流式細(xì)胞儀測得PEI-NP/miRNA=30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的凋亡率分別為(9.00+0.28)%、(7.62+0.55)%、(7.32+0.23)%、(6.27+0.09)% 、 (5.90+0.21)%、(2.05+0.09)%, 其中PEI-NP/miRNA=20:1凋亡率,比PEI-NP/miRNA=30:1和 PEI-NP/miRNA=25:1低。2.流式細(xì)胞儀檢測12、24、48 h,轉(zhuǎn)染率分別為(1.76±0.28)%、(13.03±1.64)%、(33.47±2.01)%, 48h轉(zhuǎn)染率顯著高于24 h、12 h。與對照組相比,PEI-NP/miRNA轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞NF-κB蛋白含量顯著下降,透射電鏡觀察到RAW264.7細(xì)胞內(nèi)有大量PEI-NP。肝臟組織透射電鏡只在KC內(nèi)觀察到PEI-NP分布；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組肝臟KC內(nèi)NF-κB蛋白與空載組相比表達(dá)下降。結(jié)論：1.新型PEI-NP載荷外源基因的能力強(qiáng),使實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染的設(shè)想成為可能。在PEI-NP/miRNA質(zhì)粒不同質(zhì)量比刺激細(xì)胞48 h內(nèi),細(xì)胞活性均大于90%,細(xì)胞毒性較小,滿足細(xì)胞轉(zhuǎn)染需求。細(xì)胞凋亡率隨PEI-NP濃度的增加而上升,與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。2. PEI-NP能攜帶miRNA質(zhì)粒順利的進(jìn)入體外巨噬細(xì)胞,并且在48 h時(shí)發(fā)揮的作用最明顯。PEI-NP攜帶niRNA質(zhì)粒能成功轉(zhuǎn)染體內(nèi)KC并沉默NF-κB的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：聚乙烯亞胺納米凝膠 Kupffer細(xì)胞 microRNA 核因子κB
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-13
• 前言13-14
• 第一部分 LPSNs毒性與載荷率實(shí)驗(yàn)14-21
• 1 材料與方法14-18
• 1.1 材料14-15
• 1.2 方法15-18
• 2 結(jié)果18-19
• 2.1 PEI-NP/miRNA質(zhì)粒載荷率18-19
• 2.2 PEI-NP/miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞活性19
• 2.3 細(xì)胞凋亡率19
• 3 討論19-21
• 第二部分 LPSNs介導(dǎo)miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)KC的效率21-30
• 1 材料與方法21-27
• 1.1 材料21-23
• 1.2 方法23-27
• 2 結(jié)果27-28
• 2.1 RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染率27-28
• 2.2 轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和體外轉(zhuǎn)染效果28
• 2.3 體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果28
• 3 討論28-30
• 全文總結(jié)30-31
• 參考文獻(xiàn)31-34
• 實(shí)驗(yàn)附圖34-40
• 文獻(xiàn)綜述40-49
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 致謝49-50
• 在讀期間發(fā)表論文50

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本文編號(hào)：693014