本文關(guān)鍵詞：犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞膜片的體外構(gòu)建與鑒定

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞膜片 成骨誘導(dǎo)

【摘要】：目的： 1.通過(guò)對(duì)犬進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和進(jìn)一步的純化獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs),從而獲得大量骨組織工程所需種子細(xì)胞,滿足骨組織工程的需要。 2.鑒定BMSCs干細(xì)胞成骨分化能力,用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs向成骨方向分化,并鑒定其成骨分化效果。 3.采用簡(jiǎn)易細(xì)胞膜片的方法制備犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 方法： 1、BMSCs的體外培養(yǎng)：取新生健康雜種幼犬一只,用無(wú)菌髓針穿刺脛骨抽取骨髓,采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)原代8-10天后,按1：3的比例、每2-3天／次的頻率傳代。 2、對(duì)BMSCs的體外成骨能力鑒定：用地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸鈉l0mmol/L、抗壞血酸50mg/L按一定比例配制成骨誘導(dǎo)液,對(duì)第3代BMSCs誘導(dǎo)14至21d,用茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)的形成,試劑盒檢測(cè)ALP含量的表達(dá),鑒定其成骨能力。 3、實(shí)驗(yàn)中,我們采用了簡(jiǎn)易細(xì)胞膜片的方法將犬BMSCs制備成完整的細(xì)胞膜片,同時(shí)檢測(cè)了膜片的生物學(xué)性能。 4、流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞膜片的周期檢測(cè)膜片的活力,通過(guò)HE染色和免疫組化從組織學(xué)水平觀察其結(jié)構(gòu),通過(guò)透射電鏡從超微水平觀察其結(jié)構(gòu),通過(guò)熒光定量PCRmRNA水平檢測(cè)細(xì)胞膜片細(xì)胞外基質(zhì)的情況,通過(guò)成骨誘導(dǎo)來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)其成骨能力。 結(jié)果： 1.BMSCs的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:BMSCs培養(yǎng)8-10d后可覆蓋瓶底,可以進(jìn)行傳代,通過(guò)快速的細(xì)胞增殖,細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,一直保持BMSCs長(zhǎng)梭形的典型形態(tài),整體呈旋渦式排列的生長(zhǎng)狀態(tài)。 2.BMSCs體外成骨能力鑒定的結(jié)果:BMSCs在體外被成功的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞,表現(xiàn)為茜素紅染色可見(jiàn)陽(yáng)性鈣結(jié)節(jié);與未誘導(dǎo)組相比,ALP的含量呈上升趨勢(shì),各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與未誘導(dǎo)組存在著顯著差異(P0.05)。 3.細(xì)胞膜片獲得：經(jīng)過(guò)7-10天連續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)皿底可見(jiàn)半透明乳白色薄膜樣物質(zhì),將細(xì)胞膜片小心完整刮下,分離后膜片收縮成不規(guī)則型態(tài),但保持了一定的彈性,同時(shí)具有一定的機(jī)械性能和可操作性,證明其可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 4.細(xì)胞膜片的鑒定：流式結(jié)果表明細(xì)胞膜片的活力良好,HE染色結(jié)果表明膜片由3-4層細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成,厚約20微米,免疫組化和熒光定量PCR結(jié)果分別從組織學(xué)和mRNA水平說(shuō)明了細(xì)胞外基質(zhì)中存在大量的Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白,透射電鏡結(jié)果從超微結(jié)構(gòu)上說(shuō)明細(xì)胞仍然保存了細(xì)胞活力,并分泌有細(xì)胞外基質(zhì),細(xì)胞與細(xì)胞間存在連接。 結(jié)論： 本研究證實(shí)了用全骨髓貼壁分離法可大量擴(kuò)增和純化犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,該方法簡(jiǎn)單易行,所獲的細(xì)胞可于體外成功誘導(dǎo)后向成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)以犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,體外培養(yǎng),構(gòu)建出完整的細(xì)胞膜片,有效地實(shí)現(xiàn)了種子細(xì)胞的收獲和轉(zhuǎn)移,并對(duì)其理化性質(zhì)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)及成骨作用作了系統(tǒng)性研究,為臨床骨移植修復(fù)提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞膜片 成骨誘導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)對(duì)照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 實(shí)驗(yàn)一：犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究14-29
• 1. 前言14-15
• 2. 材料和器械15-17
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法17-20
• 4. 結(jié)果20-21
• 5. 附圖21-24
• 6. 討論24-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 實(shí)驗(yàn)二：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞膜片的體外構(gòu)建與鑒定29-57
• 1. 前言29-31
• 2. 材料和器械31-32
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法32-39
• 4. 結(jié)果39-42
• 5. 附圖42-47
• 6. 討論47-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 結(jié)論56-57
• 文獻(xiàn)綜述57-74
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 致謝74-76
• 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的論文76

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 陳濤;王艷輝;卜令學(xué);李寧毅;;應(yīng)用細(xì)胞片層技術(shù)構(gòu)建功能性組織工程骨的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2011年04期

2 黃輝;張森林;劉向輝;張林;張純;;細(xì)胞-膜片復(fù)合珊瑚支架修復(fù)兔顱骨極限缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J];口腔頜面外科雜志;2011年04期

3 張森林;毛天球;;應(yīng)用富血小板血漿和骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞-膜片及其異位成骨的實(shí)驗(yàn)研究[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年03期

4 譚帥;李寧毅;荊恒;高振華;陳立強(qiáng);;犬同種異體脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞片層與內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2010年04期

5 王方;謝誠(chéng);吳國(guó)鋒;趙銥民;;組織工程牙周膜細(xì)胞片的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2011年02期

6 王玲玲;李寧毅;樊功為;卜令學(xué);楊學(xué)財(cái);高振華;;犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞片層在構(gòu)建組織工程骨中的作用[J];中國(guó)口腔頜面外科雜志;2011年02期

7 余方圓;盧世璧;崔雪梅;趙斌;許文靜;袁玫;孫明學(xué);張文濤;黃靖香;;兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞聚集培養(yǎng)的生物學(xué)性狀觀察[J];中華外科雜志;2006年12期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 于淼;BMCs膜片與種植體復(fù)合共培養(yǎng)促進(jìn)2型糖尿病大鼠骨結(jié)合[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：691856