本文關(guān)鍵詞：后發(fā)性白內(nèi)障與人工晶狀體材料的體外實驗研究

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【摘要】：背景白內(nèi)障是全球首位致盲疾病,手術(shù)是唯一的治療選擇。超聲乳化晶狀體摘除聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)是最主要的手術(shù)方式,術(shù)后可能出現(xiàn)角膜水腫、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、后發(fā)性白內(nèi)障等,其中后發(fā)性白內(nèi)障是遠期影響患者術(shù)后視力的最主要原因。后發(fā)性白內(nèi)障是指晶狀體上皮細胞向后囊膜移行、黏附、增殖及其上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化并分泌各種蛋白及其各型膠原纖維而使后囊膜發(fā)生混濁的過程,且后囊膜的收縮可使人工晶狀體移位、脫位等。后發(fā)性白內(nèi)障主要與患者的病史、手術(shù)技術(shù)、人工晶狀體等有關(guān),其中人工晶狀體是決定性因素。人工晶狀體的參數(shù)包括：外形設(shè)計、材料組成等,臨床上人工晶狀體材料主要有疏水性丙烯酸酯、親水性丙烯酸酯、硅凝膠、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。大量研究證明人工晶狀體的方形邊緣設(shè)計一定程度上能有效降低后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生,而后發(fā)性白內(nèi)障與人工晶狀體材料是否有關(guān)存在爭論；而不同的研究報道關(guān)于不同材料人工晶狀體導(dǎo)致后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生未得到一致結(jié)論；國內(nèi)外關(guān)于后發(fā)性白內(nèi)障與人工晶狀體材料關(guān)系的體外實驗研究較少。大量研究證實后發(fā)性白內(nèi)障是多因素、多細胞因子及其多信號通路共同參與的過程,而前輩們關(guān)于細胞因子、人工晶狀體及后發(fā)性白內(nèi)障的研究主要集中于在動物眼植入人工晶狀體后房水中相關(guān)細胞因子的檢測,而相關(guān)細胞因子是來源晶狀體上皮細胞還是來源于術(shù)后房水循壞的破壞未有明確定論,細胞因子的分泌與人工晶狀體材料的關(guān)系國內(nèi)外少見相關(guān)報道。TGF-β2在后發(fā)性白內(nèi)障進程中的重要作用已達到共識,大量研究報道也證實IL-6,MMP-2和MMP-9參與后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生,而TGF-β2、IL-6 MMP-2及MMP-9的表達和人工晶狀體材料的關(guān)系尚未見相關(guān)報道。第一部分不同材料人工晶狀體囊膜生物相容性的實驗研究[目的]本實驗旨在通過人晶狀體上皮細胞對不同材料人工晶狀體黏附增殖、細胞形態(tài)變化及其上皮細胞一間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的情況,探索后發(fā)性白內(nèi)障與人工晶狀體材料的關(guān)系、囊膜生物相容性最佳的人工晶狀體材料及其后發(fā)性白內(nèi)障可能的發(fā)生機制。[方法]1.細胞來源人晶狀體上皮細胞購置于American Type Culture Collection (ATCC)公司HLEC-B3系,復(fù)蘇HLEC-B3,并反復(fù)傳代、凍存、復(fù)蘇以確保細胞的數(shù)量及其質(zhì)量。2.分組將疏水性丙烯酸酯人工晶狀體、親水丙烯酸酯人工晶狀體、硅凝膠人工晶狀體、PMMA人工晶狀體,分為A組(PC156C55,PMMA)、B組(Crystalens HD,硅凝膠),C組(Akreos Advance Optics Aspheric Lens,親水性丙烯酸酯),D1組(Envista,疏水性丙烯酸酯),D2組(ZCB00 Lens,疏水性丙烯酸酯),D3組(Acrysof,疏水性丙烯酸酯)。3.黏附實驗人晶狀體上皮細胞分別種植于疏水性丙烯酸酯人工晶狀體、親水性丙烯酸酯人工晶狀體、硅凝膠人工晶狀體、PMMA人工晶狀體并培養(yǎng)6h、24 h后,在倒置相差顯微鏡下觀察人工晶狀體表面黏附細胞的數(shù)量及其形態(tài)并拍照。4.增殖計數(shù)通過CCK-8實驗檢測人工晶狀體表面培養(yǎng)24 h后人晶狀體上皮細胞的增殖情況。5.EMT實驗在人工晶狀體表面繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,對人工晶狀體表面細胞進行以a-SMA為標(biāo)記蛋白的免疫熒光,在熒光顯微鏡下拍照并計數(shù)EMT的轉(zhuǎn)化率。6.HE染色培養(yǎng)后的人工晶狀體做HE染色,觀察培養(yǎng)72 h后人工晶狀體表面細胞的形態(tài)及其增殖情況。7.數(shù)據(jù)分析所有結(jié)果采用SPSS20.0軟件做統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以mean±standard deviation表示,各組間的比較以one-way ANOVA分析,兩兩比較采用LSD檢驗,a=0.05為檢驗水準(zhǔn),認為P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]1.細胞形態(tài)正常培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞呈典型的上皮細胞樣形態(tài),為不規(guī)則的三邊形、長橢圓形、圓形為主。2.黏附實驗1)細胞種植6h后,多數(shù)細胞緊貼人工晶狀體表面生長,在顯微鏡低倍鏡下(100X)疏水性丙烯酸酯人工晶狀體和硅凝膠人工晶狀體表面黏附的細胞數(shù)較多,且三種疏水性丙烯酸酯人工晶狀體表面黏附細胞無明顯差異,PMMA人工晶狀體次之,且PMMA人工晶狀體表面可見黑色細胞團,親水性丙烯酸酯黏附的細胞最少,表面較多折光性強的小圓形細胞；高倍鏡下(400X)觀察疏水性丙烯酸酯人工晶狀體、硅凝膠人工晶狀體及其親水性丙烯酸酯人工晶狀體表面黏附細胞形態(tài)以典型上皮樣細胞為主,為不規(guī)則三邊型,長方形,橢圓形為主,尚有貼壁不牢的圓形細胞,細胞與細胞之間形態(tài)清晰,偶見1、2個長纖維型細胞；PMMA人工晶狀體表面黏附細胞許多聚集成團,增殖伸展的細胞完全融合,細胞形態(tài)模糊,在細胞團周圍可見典型的長纖維型細胞。(2)細胞培養(yǎng)24 h后,在低倍鏡下(100X)親水性丙烯酸酯人工晶狀體表面黏附細胞大部分脫壁,呈現(xiàn)為折光性弱的暗小圓形細胞,其它組人工晶狀體表面黏附細胞明顯增殖,細胞數(shù)明顯多于培養(yǎng)6h時；高倍鏡(400X)下觀察,親水性丙烯酸酯人工晶狀體表面細胞僅有幾個細胞貼壁生長并伸展成不規(guī)則三邊形及四邊形；其余各組人工晶狀體表面細胞均伸展生長,大多數(shù)細胞融合,疏水性丙烯酸酯人工晶狀體,硅凝膠人工晶狀體表面黏附細胞大多數(shù)仍為長橢圓形的上皮樣細胞為主,但可見數(shù)個典型紡錘型細胞；PMMA表面的人晶狀體上皮細胞減少,大部分細胞聚集成團,細胞團周圍可見典型的紡錘型成纖維細胞。3.增殖計數(shù)人工晶狀體表面細胞增殖反應(yīng)CCK-8各組OD值的結(jié)果顯示：D3(0.2384±0.007)D2(0.2338±0.002)D1(0.2260±0.005)B(0.1781±0.007)A(0.1580±0.007)C(0.1242±0.002)；組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0001)；其中,D1與D2組之間,表面細胞增殖無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.155),其余各組兩兩之間具有顯著性差異(P0.01)。4.EMT實驗C組親水性丙烯酸酯人工晶狀體表面細胞貼壁不牢,隨著延長培養(yǎng),幾乎無人晶狀體上皮細胞黏附,人工晶狀體表面未見熒光；其余各組人工晶狀體表面細胞免疫熒光結(jié)果示：A組,B組,D1組,D2組,D3組表面為藍染的核和綠熒光的a-SMA,其中三組疏水性丙烯酸人工晶狀體表面較多藍色的細胞核,每組約7-8個帶有綠熒光的細胞,硅凝膠人工晶狀體細胞較多,同樣約7-8個帶有綠熒光的細胞,而PMMA組細胞極少,而幾乎所有細胞均出現(xiàn)綠熒光的a-SMA纖維；在熒光顯微鏡下計算各表面細胞上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化率結(jié)果顯示：A(84.16±10.48)%B(17.33±5.71)%D1(14.22±4.64)%D2(13.99±9.11)%D3(9.98±3.80)%；其中A組同B、D1、D2、D3組之間轉(zhuǎn)化率之間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001),而B、D1、D2、D3之間均無統(tǒng)計學(xué)差異。5.HE染色結(jié)果培養(yǎng)72 h后人工晶狀體表面細胞的HE染色結(jié)果示：A、 B、C、D1、D2、D3組表面生長的人晶狀體上皮細胞核藍色,細胞質(zhì)為淡紅色；B、D1、D2、 D3組細胞明顯較A組多,其細胞結(jié)構(gòu)完整,輪廓不清,胞核清晰,為橢圓形,大小差異不明顯,高倍鏡下(400X),細胞幾乎全部融合,偶見正在分裂的細胞核及其細胞核凝集、核固縮和核碎裂現(xiàn)象；C組人工晶狀體表面可見染色的細胞,細胞結(jié)構(gòu)不完整,部分細胞未見細胞核,細胞質(zhì)內(nèi)偶見大空泡,幾乎充滿整個細胞質(zhì),細胞核大小不一,形狀各異,有四邊形、三角形、五邊形、小圓形及橢圓形；而A組細胞數(shù)明顯較少,大多聚集成團,細胞核層疊,胞核染色深,核固縮現(xiàn)象明顯,偶見核碎裂,胞質(zhì)內(nèi)可見碎裂的絲狀細胞核。[結(jié)論]在體外細胞實驗中,人工晶狀體的囊膜生物相容性與人工晶狀體的材料是相關(guān)的；從人工晶狀體表面黏附的細胞形態(tài),增殖數(shù)及其EMT免疫熒光分析,疏水性丙烯酸類人工晶狀體具有較好的囊膜生物相容性,其次為硅凝膠晶狀體、PMMA人工晶狀體；后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)展可能與人工晶狀體表面黏附的細胞數(shù)量及其增殖形式有關(guān),且人工晶狀體表面一定數(shù)量的人晶狀體上皮細胞單層增殖有利于后發(fā)性白內(nèi)障的預(yù)防。第二部分人晶狀體上皮細胞細胞因子的表達[目的]探索體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞是否表達TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,并探究細胞因子的表達和人工晶狀體材料的關(guān)系。[方法]1、將人晶狀體上皮細胞種植在人工晶狀體表面并培養(yǎng)24 h,將培養(yǎng)液收集于離心管內(nèi)并置于-80℃冰箱內(nèi)；2、依次緩慢將培養(yǎng)液復(fù)溫并將其分裝成4部分,分別對培養(yǎng)液進行TGF-β2、 IL-6、MMP-2和MMP-9 ELISA檢測；3、所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料以mean±tandard deviation表示,各組間的比較以one-way ANOVA分析,兩兩比較采用LSD檢驗,以a=0.05為檢驗水準(zhǔn),認為P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]在人工晶狀體與人晶狀體上皮細胞混合培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液中能檢測出TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,其中IL-6和MMP-9的分泌水平趨勢大致相同,以PMMA人工晶狀體組分泌最高,其次為疏水性丙烯酸酯人工晶狀體組,硅凝膠人工晶狀體,親水性丙烯酸酯人工晶狀體較低,而TGF-β2和MMP-2的表達水平以疏水性丙烯酸人工晶狀體組最高,其次為硅凝膠人工晶狀體組,PMMA組和親水性丙烯酸酯組較低；TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9的分泌水平各組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。[結(jié)論]人晶狀體上皮細胞能合成分泌TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,且人工晶狀體可能誘導(dǎo)人晶狀體上皮合成分泌TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,其分泌水平可能同人工晶狀體的材料無關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：人工晶狀體 人晶狀體上皮細胞 后發(fā)性白內(nèi)障 囊膜生物相容性 人晶狀體上皮細胞 人工晶狀體 TGF-β _2 IL-6 MMP-2 MMP-9
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R779.66;R318.18
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-19
• 第一章 不同材料人工晶狀體囊膜生物相容性的實驗研究19-40
• 1 儀器及試劑19-20
• 1.1 主要儀器及材料19-20
• 1.2 主要試劑20
• 2 實驗方法20-24
• 3 結(jié)果24-27
• 3.1 正常培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞形態(tài)為典型上皮樣細胞24
• 3.2 黏附結(jié)果24-25
• 3.3 CCK-8增殖結(jié)果25
• 3.4 EMT免疫熒光結(jié)果25-26
• 3.5 HE染色結(jié)果26-27
• 4 討論27-30
• 5 結(jié)論30-32
• 6 附圖32-40
• 第二章 人晶狀體上皮細胞細胞因子的表達40-49
• 1 材料與試劑40
• 1.1 主要材料40
• 1.2 主要試劑40
• 2 實驗方法40-43
• 3 結(jié)果43-44
• 3.1 IL-6分泌結(jié)果43
• 3.2 TGF-β2分泌結(jié)果43
• 3.3 MMP-2分泌結(jié)果43-44
• 3.4 MMP-9分泌結(jié)果44
• 4 討論44-47
• 5 小結(jié)47
• 6 附圖47-49
• 第三章 總結(jié)49-50
• 參考文獻50-58
• 附錄A 中英文對照縮略詞表58-59
• 附錄B 成果59-60
• 綜述60-87
• 參考文獻76-87
• 致謝87-89

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1 徐國興;潘永明;;人工晶狀體材料與人工晶狀體植入術(shù)并發(fā)癥及不良事件[J];海峽科學(xué);2007年03期

2 夏瑞靜;徐栩;羅麗;李玲t(yī) ;陳浩;;氧等離子處理人工晶狀體材料的生物相容性[J];中國組織工程研究;2013年21期

3 劉芳;周曉蓮;崔鳳萍;賈德民;;聚甲基丙烯酸羥乙酯水凝膠人工晶狀體材料的合成與性能[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2007年03期

4 ;[J];;年期

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1 黃琪;后發(fā)性白內(nèi)障與人工晶狀體材料的體外實驗研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號：686291