本文關(guān)鍵詞：微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞對多孔磷酸鈣生物材料骨誘導(dǎo)性的作用研究

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【摘要】：一、背景目前,各種高能量損傷導(dǎo)致患者發(fā)生創(chuàng)傷及骨組織缺損的情況越來越多,骨組織工程學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。骨組織工程學(xué)是用工程學(xué)和生命科學(xué)原理,以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞等種子細(xì)胞,在體外培養(yǎng)并擴(kuò)增后,與天然或人工合成的可降解支架材料復(fù)合形成組織工程骨,移植到患者骨缺損部位進(jìn)行損傷修復(fù)。在多種生物材料中,人工合成的骨替代材料,多孔磷酸鈣生物材料是其中的代表。多孔磷酸鈣生物材料特殊的制備工藝、孔徑結(jié)構(gòu)及材料表面特征等多方面原因使其具有骨誘導(dǎo)性能。目前,多孔磷酸鈣生物材料骨誘導(dǎo)過程及機(jī)制經(jīng)國內(nèi)外大量學(xué)者的探索已有了一定的理論基礎(chǔ),但其誘導(dǎo)機(jī)理還存在很多未解之謎。本課題我們試圖對間充質(zhì)干細(xì)胞在多孔磷酸鈣生物材料骨誘導(dǎo)中的作用進(jìn)行研究,進(jìn)一步了解多孔磷酸鈣生物材料的骨誘導(dǎo)機(jī)制,使其更好地應(yīng)用于臨床患者骨缺損的修復(fù)。二、目的運(yùn)用細(xì)胞膜熒光染料PKH-26及PKH-67標(biāo)記MSCs,體內(nèi)示蹤探討MSCs在多孔磷酸鈣生物材料骨誘導(dǎo)中的作用,進(jìn)一步了解多孔磷酸鈣生物材料的骨誘導(dǎo)機(jī)制,使多孔磷酸鈣生物材料更好的治療因高能量損傷或炎癥導(dǎo)致的骨質(zhì)缺損。三、方法1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定選用兔BMSCs作為種子細(xì)胞,梯度密度離心法分離,貼壁法培養(yǎng),并對其進(jìn)行傳代、鑒定,確保最終實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為分裂穩(wěn)定且分化潛能具有多向性的細(xì)胞。2.熒光標(biāo)記BMSCs取生長狀態(tài)良好3代BMSCs,經(jīng)胰蛋白酶消化,制作單細(xì)胞懸液。按照sigma公司提供的步驟對上述BMSCs進(jìn)行PKH-26和PKH-67熒光標(biāo)記,然后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):(1)流式細(xì)胞儀準(zhǔn)確檢測BMSCs的標(biāo)記率;(2)標(biāo)記后接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿和放置蓋玻片的培養(yǎng)板內(nèi),熒光顯微鏡觀察剛標(biāo)記的細(xì)胞懸液和24h后細(xì)胞的標(biāo)記效果;(3)檢測標(biāo)記前后BMSCs的生物學(xué)性狀;(4)和金世植骨靈復(fù)合后植于兔臀肌內(nèi),3、7、12、15周標(biāo)本不脫鈣樹脂包埋切片,熒光顯微鏡觀察,確定PKH-26及PKH-67體內(nèi)示蹤熒光效果及示蹤時(shí)間。3.動物手術(shù)操作實(shí)驗(yàn)用兔36只隨機(jī)分為三組,每組12只,A組為血管注射組,B組為局部注射組,C組為對照組。操作完畢后記錄順序并標(biāo)記。術(shù)后由西部戰(zhàn)區(qū)蘭州總醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)。給予充足的食物和飲水,飼養(yǎng)籠墊料保持干燥,術(shù)后觀察。4.BMP-2基因表達(dá)量測定實(shí)驗(yàn)動物處死后,分批取含材料周圍1cm組織的標(biāo)本,剔除軟組織新鮮標(biāo)本液氮冷凍,RT-PCR分析BMP-2基因表達(dá)量。5.組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)動物處死后,取材行4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,進(jìn)行Masson染色和Alkaline Phospatase免疫組化及Collagen I免疫組化觀察各實(shí)驗(yàn)組的成骨活力及新生骨生成情況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行,單因素方差分析(ANOVA),數(shù)據(jù)以((?)±s)標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)法。P0.05為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、研究結(jié)果1.BMSCs可穩(wěn)定傳至第三代,流式細(xì)胞儀檢測,BMSCs CD 90陽性表達(dá),陽性率95.24%,CD 45陰性表達(dá)。PKH-26及PKH-67熒光標(biāo)記即時(shí)后熒光顯微鏡鏡下觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs成圓球形,熒光均勻分布于細(xì)胞膜表面;24 h后BMSCs熒光穩(wěn)定表達(dá),細(xì)胞呈梭形排列。MTT檢測及成骨和成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示熒光標(biāo)記不影響其生物學(xué)性狀。PKH-26及PKH-67染色陽性率分別為93.65%及91.37%。2.BMSCs熒光體內(nèi)標(biāo)記,熒光顯微鏡下觀察3、7、12、15周各時(shí)間點(diǎn)PKH-26及PKH-67熒光都能穩(wěn)定表達(dá),在組織切片可見廣泛分布的紅色或綠色標(biāo)記的熒光光點(diǎn)。15周時(shí)PKH-26熒光表達(dá)強(qiáng)度穩(wěn)定,PKH-67熒光強(qiáng)度稍有減弱。3.術(shù)后實(shí)驗(yàn)用兔用空氣栓塞法處死取材,硬組織切片熒光顯微鏡觀察顯示,A組在3、7、12周熒光分布均勻,強(qiáng)度穩(wěn)定表達(dá),B組在3周分布不均,7到12周分布趨于均勻,對照C組無熒光;BMP-2基因表達(dá)量測定實(shí)驗(yàn)組A、B組與對照組C組在不同時(shí)間段BMP-2基因表達(dá)量都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),A組與B組之間在不同時(shí)間段差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.組織學(xué)結(jié)果Masson染色顯示,A、B實(shí)驗(yàn)組和C組對照組從7周開始都有骨小梁形成,但新生骨和膠原纖維組織量在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)從A組到C組遞減。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ALP和COL I表達(dá)與上述一致。五、研究結(jié)論1、本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)的BMSCs,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀測試鑒定,細(xì)胞為BMSCs,復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)。2、PKH-26和PKH-67作為BMSCs的熒光標(biāo)記物,不影響B(tài)MSCs的形態(tài)、增殖和分化。3、多孔磷酸鈣生物材料誘導(dǎo)微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞向人工骨材料貼附,并增殖分化為成骨細(xì)胞,進(jìn)而形成新生骨,周圍血管及體液中的間充質(zhì)干細(xì)胞均是成骨細(xì)胞來源,血管來源的間充質(zhì)干細(xì)胞起主要作用。4、本實(shí)驗(yàn)研究成果可為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：多孔磷酸鈣生物材料 BMSCs PKH-26 熒光標(biāo)記 骨組織工程
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R68
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 文獻(xiàn)回顧13-25
• 1 多孔磷酸鈣生物材料骨誘導(dǎo)性的研究進(jìn)展13-17
• 2 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展17-22
• 3 間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記22-25
• 實(shí)驗(yàn)一 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外標(biāo)記及體內(nèi)示蹤研究25-35
• 1 材料與儀器25-27
• 2 實(shí)驗(yàn)方法27-29
• 3 結(jié)果29-34
• 4 討論34-35
• 實(shí)驗(yàn)二 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在材料成骨中的作用研究35-48
• 1 材料與儀器35-37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法37-41
• 3 結(jié)果41-46
• 4 討論46-48
• 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-58
• 個(gè)人簡歷和研究成果58-59
• 致謝59

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1 杜宗，

本文編號：676194