本文關(guān)鍵詞：ADSCs在組織工程化軟組織當(dāng)中的應(yīng)用與研究

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【摘要】：1目的 隨著在組織工程技術(shù)及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,組織工程技術(shù)在角膜、肝、胰、軟骨、骨、血管、尿道、神經(jīng)系統(tǒng)等領(lǐng)域均取得了巨大的成就,而組織工程技術(shù)在整形外科的應(yīng)用還處于起步階段。具有“主動修復(fù)功能”和“可調(diào)控生物響應(yīng)特性”的第三代含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和未來的發(fā)展方向。然而,目前含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料仍有很多問題尚未解決,如復(fù)合組織材料在組織修復(fù)再生過程中與宿主間相互作用的機(jī)理尚不清楚。材料在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸、對宿主局部微環(huán)境及全身防御和再生體系的影響尚不確定等。上述問題極大地阻礙了復(fù)合組織材料的開發(fā)與應(yīng)用。 本實(shí)驗(yàn)以脂肪來源干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells ADSCs)為種子細(xì)胞,以可以注射的游離脂肪顆粒、透明質(zhì)酸凝膠(hyaluronic acid HA)為細(xì)胞支架材料,構(gòu)建含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料。通過研究含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料在組織修復(fù)再生過程中與宿主的相互作用,闡明復(fù)合組織材料在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸、對宿主微環(huán)境及全身的影響,揭示復(fù)合組織材料與宿主相互作用的調(diào)控機(jī)制；建立新型復(fù)合組織材料的篩選、研發(fā)的理論體系和關(guān)鍵技術(shù),為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。2方法2.1脂肪來源干細(xì)胞的分離提取培養(yǎng)及鑒別 1)ADSCs分離,脂肪組織來源于整形外科脂肪抽吸病人,患者自愿捐獻(xiàn)白體脂肪組織用于本次試驗(yàn)。2)膠原酶消化法提取脂肪來源性干細(xì)胞,分離、收集原代ADSCs按4×105有核細(xì)胞/ml細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),常用的75mm塑料培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞,加入低糖DMEM+10%FBS完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。用胰酶消化傳代,收集第3代細(xì)胞作為種子細(xì)胞和檢測對象。3)流式細(xì)胞儀測定干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD49、CD105等,該方法僅用以證明該細(xì)胞群有干細(xì)胞特性,不影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.2細(xì)胞一生物支架復(fù)合物取材、制備和植入： 以脂肪顆粒和透明質(zhì)酸為支架材料,和種子細(xì)胞混合制成細(xì)胞-生物支架復(fù)合物,本次實(shí)驗(yàn)共分5組：組①以ADSCs為種子細(xì)胞按25×106個/ml濃度與純化后的脂肪顆粒1：1等體積混合配置成ADSCs+游離脂肪顆粒復(fù)合物；組②以單純ADSCs為一組,將ADSCs配置成濃度為12.5×106個/ml懸液備用；組③以單純純化過的脂肪顆粒為一組；組④ADSCs按25×106個/ml濃度與醫(yī)用透明質(zhì)酸以1：1等體積混合；組⑤單純透明質(zhì)酸組；。按每組0.2ml注射至裸鼠(12只,5W雄性)背部皮下,形成5個點(diǎn),每組各1個點(diǎn),觀察裸鼠植入后的生命體征及局部炎癥反應(yīng)情況,3個月后取材,用于檢測與分析。將取材所獲得的新生組織分別從體積、質(zhì)量、組織學(xué)、mRNA表達(dá)、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行研究。3結(jié)果 本次試驗(yàn)12只裸鼠局部植入填充物后生命體征平穩(wěn),每只裸鼠注射部位均未見明顯的炎癥反應(yīng),組①、②、③、④均可見有新生組織形成,組⑤未見新生組織形成。大體觀,組③、①可見明顯有黃色脂肪顆粒型成,組②、④未見明顯黃色脂肪脂肪顆粒,利用Masson三色染色染色法可見①、②、③、④四個組中均可見脂肪細(xì)胞,及膠原蛋白,其中ADSCs+游離脂肪顆粒組中富含膠原及脂肪顆粒,且脂肪顆粒及膠原結(jié)締組織排列較規(guī)則,脂肪顆粒細(xì)胞大小不均勻,有新生脂肪顆粒細(xì)胞。單純ADSCs移植入組可見大量的膠原形成,無明顯成熟的脂肪顆粒細(xì)胞,排列紊亂,無明顯規(guī)律。透明質(zhì)酸--ADSCs組與單純ADSCs組接近,富含膠原蛋白排列有序,未見明顯成熟脂肪細(xì)胞,單純游離脂肪顆粒移植入組可見大量脂肪細(xì)胞形成,排列規(guī)律,大小均勻,膠原蛋白形成相對較少。四組中體積組①組③組④組②,質(zhì)量組①組③=組④組②,組③與組④之間質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR示四組中均見到人類mRNA表達(dá),提示新生組織來自植入的復(fù)合組織。Western blot示四組中均可見Ⅰ型膠原蛋白表達(dá),其含量有組②≈組④組①組③的趨勢。 4結(jié)論 ADSCs其表面抗原較弱,不易產(chǎn)生抗原,不產(chǎn)生致熱源,局部注射產(chǎn)生炎癥反應(yīng)較輕,注射局部無明顯炎癥反應(yīng)。ADSCs可分泌內(nèi)皮細(xì)胞生長因子促進(jìn)局部血管形成,減少移植脂肪細(xì)胞缺血時間,降低游離脂肪顆粒移植后的吸收率,游離脂肪顆�？梢詾锳DSCs提供微環(huán)境促使其向成熟脂肪細(xì)胞分化；透明質(zhì)酸可以為ADSCs提供生物支架,透明質(zhì)酸+ADSCs復(fù)合生物材料植入宿主后可以構(gòu)建新生組織,促進(jìn)局部膠原蛋白分泌；單純ADSCs可以促進(jìn)局部膠原蛋白的分泌,可以形成新的軟組織；單純透明質(zhì)酸凝膠局部注射不能形成新的軟組織。
【關(guān)鍵詞】：脂肪來源干細(xì)胞 組織工程技術(shù) 脂肪移植 膠原蛋白
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 英文對照~.略詞表12-13
• 前言13-19
• 材料與方法19-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-41
• 討論41-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 綜述51-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 個人簡歷63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文63-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：674375