本文關(guān)鍵詞：基于脫細(xì)胞基質(zhì)支架的輸尿管組織工程研究

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【摘要】：輸尿管作為腹膜后位器官,損傷發(fā)生的機(jī)率很低,但近年來隨著腔鏡技術(shù)在臨床中的廣泛應(yīng)用,輸尿管損傷發(fā)生的概率逐年升高。常規(guī)手術(shù)治療方式(輸尿管斷端吻合,輸尿管的再植,膀胱成形術(shù)等)可以恢復(fù)輸尿管結(jié)構(gòu)的連續(xù)性,而不能完全恢復(fù)其功能,且常伴有一些術(shù)后并發(fā)癥,例如：復(fù)發(fā)性狹窄,漏尿以及腎臟損害等。隨著組織工程技術(shù)在泌尿系統(tǒng)中的廣泛應(yīng)用,為輸尿管的修復(fù)重建提供了新的契機(jī)。組織工程學(xué)融合了材料學(xué)、生命科學(xué)和工程學(xué)的理念,屬于前沿交叉學(xué)科領(lǐng)域,研究的最終目的是體外構(gòu)建具有生物學(xué)功能的工程化輸尿管,替換體內(nèi)受損的輸尿管組織,達(dá)到臨床治愈的目標(biāo)。隨著組織工程技術(shù)在泌尿系統(tǒng)廣泛而深入的研究,體外構(gòu)建工程化輸尿管的研究也有了很多突破性的進(jìn)展,但尚未構(gòu)建出理想的工程化輸尿管組織,用于臨床的治療。其中支架材料問題是其主要原因之一。輸尿管細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分較為復(fù)雜,現(xiàn)階段技術(shù)條件很難在體外完全模擬出細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境。脫細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,使得制備脫細(xì)胞基質(zhì)材料成為可能,受到了廣泛的關(guān)注和研究。脫細(xì)胞基質(zhì)材料獨(dú)有的特點(diǎn)是將細(xì)胞成分從組織或器官中清除,同時(shí)能夠很好地保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分,因而是較為理想的組織工程支架材料。輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)常用的制備方法為物理攪拌同時(shí)結(jié)合化學(xué)洗滌劑的洗脫作用,來達(dá)到脫細(xì)胞效果,這一制備過程需消耗較長的時(shí)間,且制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的成分常遭到破壞。此外,長時(shí)間的攪拌和化學(xué)洗滌劑作用,也會破壞脫細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響組織工程輸尿管的構(gòu)建。因此,探尋一種快速,便捷的脫細(xì)胞方案,使制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞成分被完全清除,同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分得到很好地保留,對以后的輸尿管再造研究具有重要的意義。既往的研究報(bào)道,細(xì)胞外基質(zhì)在調(diào)控干細(xì)胞分化中扮演著重要的角色。DeQuach等人的研究表明,骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)能夠促進(jìn)肌源性干細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞分化,心臟脫細(xì)胞基質(zhì)能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。有文獻(xiàn)報(bào)道脫細(xì)胞基質(zhì)的硬度在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化起到重要的作用,質(zhì)地較為堅(jiān)硬的基質(zhì)有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,相反質(zhì)地較軟的基質(zhì)更有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。此外,也有關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)中某些組分可以促進(jìn)干細(xì)胞的分化的報(bào)道。但關(guān)于輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)成分在促進(jìn)干細(xì)胞分化方面的研究尚未有報(bào)道。基于以上問題的分析,本論文主要從以下三方面進(jìn)行了相關(guān)研究：第一部分：輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的灌注制備及條件優(yōu)化目的：探索灌注系統(tǒng)在制備輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)中的可行性,并對制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)且詳細(xì)地評價(jià)。方法：利用輸尿管本身存在的管腔結(jié)構(gòu),通過灌注系統(tǒng)制備輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)。根據(jù)化學(xué)洗滌劑的不同特性設(shè)置3個不同的灌注組,單純SDS組、單純TritonX-100組以及聯(lián)合組(TritonX-100+SDS)。結(jié)果：HE染色和DAPI染色顯示聯(lián)合組制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)中沒有明顯的核物質(zhì)殘留,DNA定量和凝膠電泳證實(shí)了這一結(jié)果。Masson's三色染色、Alcian Blue染色、膠原含量測定和GAG含量測定顯示聯(lián)合組保留了輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)三維膠原結(jié)構(gòu)和生物活性成分。掃描電鏡觀察聯(lián)合組制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)表面存在大量的孔隙結(jié)構(gòu)。結(jié)論：灌注系統(tǒng)可用于輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的制備,篩選出一套比較理想的脫細(xì)胞方案,制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)可作為輸尿管組織工程再造。第二部分：輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的生物相容性評價(jià)和再細(xì)胞化目的：對制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行生物相容性評價(jià),并進(jìn)行再細(xì)胞化研究。方法：通過AO/PI染色和MTT檢測評價(jià)輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的生物相容性；將犬膀胱平滑肌細(xì)胞種植在輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的表面,觀察脫細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞的生長行為。結(jié)果：AO/PI染色和MTT檢測顯示平滑肌細(xì)胞可在輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)浸提液中生長和增殖;HE染色、DAPI染色和PCNA染色顯示犬膀胱平滑肌細(xì)胞可在輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)中粘附、生長、遷移和增殖。結(jié)論：制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好的生物相容性,可用做輸尿管組織工程的支架材料。第三部分：輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)成分誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的分化目的：探尋輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)成分是否可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化。方法：將犬脂肪干細(xì)胞種植在鋪有輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)消化液的蓋玻片上,觀察脂肪干細(xì)胞的分化情況。結(jié)果：免疫熒光染色顯示脂肪干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化,Western Blot檢測顯示有平滑肌蛋白的表達(dá)。結(jié)論：輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)成分可以誘導(dǎo)犬脂肪干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。綜上所述,本論文將灌注系統(tǒng)引入到輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的制備中,并成功篩選出一套適用于制備犬輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的脫細(xì)胞方案。同時(shí)對制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)且詳細(xì)的評價(jià),證實(shí)制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)很好地清除了細(xì)胞核成分,同時(shí)較好地保留了輸尿管的三維結(jié)構(gòu)和生物活性成分。并且驗(yàn)證了所制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好的生物相容性,進(jìn)行了再細(xì)胞化實(shí)驗(yàn),表明優(yōu)化后的脫細(xì)胞方案所制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)可用作輸尿管組織工程的支架材料。進(jìn)一步研究表明輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)組分可促進(jìn)犬脂肪干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：輸尿管 脫細(xì)胞基質(zhì) 組織工程 支架
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R699.4
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 第一部分：輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的灌注制備及條件優(yōu)化17-27
• 1. 材料17-19
• 2. 方法19-23
• 3. 結(jié)果23-25
• 4. 討論25-27
• 第二部分：輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的生物相容性評價(jià)和再細(xì)胞化27-35
• 1. 材料27-28
• 2. 方法28-31
• 3. 結(jié)果31-33
• 4. 討論33-35
• 第三部分：輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)成分誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的分化35-43
• 1. 材料35-36
• 2. 方法36-39
• 3. 結(jié)果39-41
• 4. 討論41-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 綜述47-53
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況53-54
• 致謝54

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本文編號：621619