本文關鍵詞：Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)復合人牙髓前體細胞的神經(jīng)移植物生物學特性研究

  更多相關文章： 脫細胞神經(jīng) Myroilysin酶法 Sondell化學法 牙髓前體細胞 STRO-1 S-100 生物相容性 降解速率 方向性生長 NGF BDNF

【摘要】：周圍神經(jīng)損傷因可能造成機體感覺和運動功能的部分或全部喪失,從而嚴重影響機體的功能行使和生活質量,其修復再生一直備受關注。利用組織工程學的原理和方法制備人工神經(jīng)以修復周圍神經(jīng)缺損是這一研究領域的熱點。本課題正是基于此欲構建一種新型的組織工程化神經(jīng)移植物并對其生物學性能進行評價,為獲得可橋接周圍神經(jīng)缺損并可促進周圍神經(jīng)再生以及功能恢復的生物性神經(jīng)移植物做一臨床前研究。 第一部分Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架的制備與結構觀察 目的：制備一種新型脫細胞異種神經(jīng)支架并對其進行結構觀察。 方法：獲取新西蘭大白兔坐骨神經(jīng)后,分別利用經(jīng)典是Sondell化學法和新型Myroilysin酶對其進行脫細胞處理,大體觀察并制作組織切片經(jīng)HE染色、Masson染色后光學顯微鏡下觀察脫細胞神經(jīng)支架的脫細胞效果、所保留神經(jīng)基底膜結構以及膠原結構,制作電鏡標本通過掃描電鏡觀察不同方法制備的神經(jīng)支架的表面物理性狀。 結果：經(jīng)Sondell化學法處理的神經(jīng)直徑基本無變化或稍小于天然神經(jīng),但經(jīng)Myroilysin酶法處理的神經(jīng)有膨脹現(xiàn)象并且更為透明。組織學觀察,Myroilysin脫細胞神經(jīng)獲得了與經(jīng)典Sondell化學法一致的結果,細胞、軸突、髓鞘結構消失,神經(jīng)基底膜呈波浪狀,膠原纖維排列均勻有序。掃描電鏡結果顯示Myroilysin酶法比化學法獲得的神經(jīng)支架結構呈現(xiàn)更為明顯的縱形溝壑狀。 結論：Myroilysin酶法作為一種新型的脫細胞神經(jīng)支架制備方法,與sondell具有類似的脫細胞效果,并且利用該方法制備的神經(jīng)支架同樣保留有均勻一致的基底膜結構。但Myroilysin脫細胞神經(jīng)支架更為明顯的縱形溝壑狀結構可能對種子細胞的生長有“地形誘導”作用,是值得考慮的一種神經(jīng)支架材料。 第二部分人牙髓前體細胞的培養(yǎng)以及與神經(jīng)組織細胞相關的蛋白表達 目的：培養(yǎng)牙髓前體細胞并初步鑒定,探討其作為組織工程化神經(jīng)移植物種子細胞的可行性。 方法：獲取臨床就診的15-18歲患者中因正畸需要拔除并且牙根尚未完全發(fā)育完成的第三恒磨牙牙髓組織。按照Gronthos酶消化法進行原代培養(yǎng),獲得牙髓細胞,并進行傳代,對其第三代細胞進行免疫熒光染色,鑒定間充質干細胞標記STRO-1和周圍神經(jīng)雪旺細胞標記S-100。 結果：獲得了能夠高度增殖的細胞,免疫熒光結果顯示所培養(yǎng)的細胞中存在STRO-1陽性的細胞,同時也存在S-100陽性的細胞。 結論：本研究所獲得的細胞中存在牙髓前體細胞,并且存在與某些神經(jīng)細胞功能相似的細胞,將S-100陽性的牙髓前體細胞作為周圍神經(jīng)組織工程的種子細胞以獲得更具神經(jīng)營養(yǎng)功能的神經(jīng)移植物具有一定的可行性。 第三部分Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架的生物學性能 目的：評價Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架的生物學性能,探討牙髓前體細胞與該神經(jīng)支架的生物適合性,為將來構建用于臨床使用的新型人工神經(jīng)提供理論依據(jù)。 方法：制備脫細胞神經(jīng)支架浸提液,與牙髓前體細胞共培養(yǎng),通過CCK-8細胞增殖試驗評價該支架的細胞相容性；將脫細胞異種神經(jīng)支架植入Wistar大鼠皮下,術后分別在1周和4周取材,制作組織切片鏡下觀察支架與周圍組織的反應以評價其組織相容性。利用Ⅰ型膠原酶酶解天然神經(jīng)和Myroilysin脫細胞神經(jīng),比較二者的膠原穩(wěn)定性,從而評價其降解情況。將人牙髓前體細胞植入Myroilysin脫細胞神經(jīng)支架,通過EdU試驗,觀察細胞在支架上生長的排列模式。將牙髓前體細胞與Myroilysin脫細胞神經(jīng)浸提液共培養(yǎng),通過實時熒光PCR相對定量分析支架浸提液對牙髓前體細胞表達神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF和BDNF在mRNA水平的影響。 結果：牙髓前體細胞與Myroilysin脫細胞神經(jīng)浸提液共培養(yǎng)4天至6天后,其增殖活性高于其單獨培養(yǎng),表現(xiàn)出良好的細胞相容性；該支架材料植入大鼠背部皮下后,雖在植入早期出現(xiàn)急性炎癥,但隨即呈現(xiàn)組織修復過程,未出現(xiàn)不良反應,具有良好的組織相容性。Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架的降解速率與天然神經(jīng)基本一致。Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架可使牙髓前體細胞粘附其上并呈現(xiàn)較為明顯的方向性生長方式。牙髓前體細胞與Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架浸提液共培養(yǎng)后,神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF和BDNF在mRNA水平出現(xiàn)了上調。 結論：Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架具有良好的生物相容性和體外降解速率,其多孔的縱形溝壑狀結構可發(fā)揮“地形誘導”作用,同時其保留較好的周圍神經(jīng)細胞外基質成分具有一定的生物學誘導,可使牙髓前體細胞粘附其上并呈現(xiàn)較為明顯的方向性生長,并可促進牙髓前體細胞對神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF和BDNF的表達。牙髓前體細胞與Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架這一細胞外基質之間具有良好的適合性,可能成為組織工程化神經(jīng)移植物的新選擇之一。
【關鍵詞】：脫細胞神經(jīng) Myroilysin酶法 Sondell化學法 牙髓前體細胞 STRO-1 S-100 生物相容性 降解速率 方向性生長 NGF BDNF
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.3;R318.19
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 英文縮略語表12-13
• 前言13-16
• 第一部分 Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架的制備與結構觀察16-23
• 材料和方法16-19
• 結果19-20
• 討論20-22
• 小結22-23
• 第二部分 人牙髓前體細胞的培養(yǎng)以及與神經(jīng)組織細胞相關的蛋白表達23-30
• 材料和方法23-26
• 結果26-27
• 討論27-29
• 小結29-30
• 第三部分 Myroilysin脫細胞異種神經(jīng)支架的生物學性能30-44
• 材料和方法30-36
• 結果36-38
• 討論38-43
• 小結43-44
• 全文總結44-46
• 附圖46-51
• 參考文獻51-56
• CASE REPORT56-76
• Case report 156-65
• Case report 265-76
• 致謝76-77
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文77-78
• 學位論文評閱及答辯情況表78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭義柱;盧世璧;王巖;劉相成;梁雨田;孫明學;唐金樹;黃靖香;;去細胞同種異體神經(jīng)移植修復人體長段周圍神經(jīng)缺損[J];中國臨床康復;2005年38期

2 孔岳南;孫楊;;神經(jīng)組織工程生物材料的生物相容性及安全性評價[J];中國組織工程研究與臨床康復;2008年32期

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本文編號：570194