本文關(guān)鍵詞：PDMS基底硬度與形貌協(xié)同對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]探討聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)基底硬度與表面形貌二者協(xié)同對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone mesenchymal stem cells, rBMSCs)鋪展形態(tài)、增殖以及成骨分化的影響,探索基底硬度和形貌是否能協(xié)同促進(jìn)rBMSCs成骨分化,尋找利于間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的基底硬度和形貌范圍,為材料界面改性及新骨組織工程材料的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。[方法]1、人股骨骨與細(xì)胞界面硬度和形貌的表征 利用原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)分別測(cè)量骨與細(xì)胞界面的硬度和形貌,以此為依據(jù)制備具有不同硬度和表面形貌的PDMS基底。2、仿生骨與細(xì)胞界面硬度和形貌的PDMS基底的制備利用電子束曝光及等離子體刻蝕技術(shù)制作具有不同脊槽結(jié)構(gòu)的硅片模板,復(fù)模得到具有不同硬度和形貌的PDMS基底。分組：A組硬度3.5 MPa,無脊槽結(jié)構(gòu)；B組硬度3.5 MPa,槽、脊寬300 nm；C組硬度3.5 MPa,槽、脊寬1800 nm; D組硬度0.27 MPa,無脊槽結(jié)構(gòu)；E組硬度0.27 MPa,槽、脊寬為300 nm；F組硬度0.27 MPa,槽、脊寬1800 nm。3、不同硬度和形貌PDMS基底上rBMSCs增殖、形態(tài)與成骨分化檢測(cè)在以上各組PDMS基底上培養(yǎng)rBMSCs,利用倒置熒光顯微鏡觀察rBMSCs的形態(tài),CCK-8試劑盒檢測(cè)rBMSCs的增殖情況,堿性磷酸酶(alkalinephosphatase, ALP)試劑盒檢測(cè)rBMSCs的ALP活性,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)骨鈣蛋白(osteocalcin, OCN)及Ⅰ型膠原(collagen type I, COLI)的表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)Runx2(runt-related transcription factor 2) mRNA的表達(dá)。[結(jié)果]1、骨與細(xì)胞界面的硬度和形貌,即細(xì)胞外基質(zhì)的硬度和形貌。發(fā)現(xiàn)構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的膠原纖維的直徑為289±118nm、365±140nm、198±98 nm。而細(xì)胞外基質(zhì)表面由膠原蛋白、蛋白聚糖、粘多糖等復(fù)合物組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的硬度為0.93±0.09 MPa、3.58±0.14MPa、2.44±0.20 MPa。2、按質(zhì)量比5：1與33：1混合184預(yù)聚物和184固化劑所得PDMS基底的硬度為3.5-±-0.16 MPa和0.27±0.015 MPa,SEM測(cè)量復(fù)型得到的PDMS基底表面脊槽寬分別為300 nm和1 800nm。3、在3.5 MPa的PDMS基底上,rBMSCs鋪展充分,細(xì)胞面積大,呈多角形,細(xì)胞骨架排列緊張；在0.27 MPa的PDMS基底上,rBMSCs面積較小,呈圓球形,胞內(nèi)骨架蛋白較少。在相同硬度條件下,脊、槽寬為1 800nm的PDMS基底對(duì)rBMSCs鋪展有明顯的引導(dǎo)作用,細(xì)胞沿著脊槽方向呈長(zhǎng)梭形鋪展；而在脊、槽寬為300 nm的PDMS基底及無脊槽結(jié)構(gòu)的平面PDMS基底上,rBMSCs任意鋪展,呈多角形。rBMSCs在硬度為3.5 MPa的PDMS基底上增殖率明顯高于在0.27 MPa的PDMS基底上的增殖率,而在脊、槽寬分別為300 nm、1800nm的PDMS基底及無脊槽結(jié)構(gòu)的平面PDMS基底上rBMSCs的增殖無明顯差異。硬度相同的條件下,脊、槽寬為300 nm的PDMS基底上ALP活性,OCN、COL!及Runx2 mRNA表達(dá)量均明顯高于脊、槽寬為1 800 nm的PDMS基底及無脊槽結(jié)構(gòu)的平面PDMS基底；在形貌相同的條件下,3.5 MPa基底上ALP活性,OCN、COLI及Runx2 mRNA表達(dá)量與0.271MPa基底相比亦增高。[結(jié)論]1、基底硬度和形貌均能影響rBMSCs的形態(tài)。2、基底硬度促進(jìn)rBMSCs增殖更明顯。3、硬基底與脊槽結(jié)構(gòu)能協(xié)同促進(jìn)rBMSCs成骨分化,硬度3.5 MPa、脊槽寬為300nm的基底促rBMSCs成骨分化趨勢(shì)更顯著。4、本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有助于了解物理因素在某些疾病(如骨質(zhì)疏松)發(fā)病機(jī)制過程中的作用,并可為骨組織工程新材料的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 硬度 形貌
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 縮略詞表8-9
• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 1 緒論14-18
• 1.1 問題的提出與研究意義14-15
• 1.1.1 問題的提出14-15
• 1.1.2 研究意義15
• 1.2 本文研究目的和內(nèi)容15-18
• 1.2.1 研究目的15
• 1.2.2 研究?jī)?nèi)容15-16
• 1.2.3 技術(shù)路線16-17
• 1.2.4 創(chuàng)新點(diǎn)17-18
• 2 人股骨骨與細(xì)胞界面形貌和硬度的表征18-24
• 2.1 引言18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品18
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑19
• 2.2.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法19-21
• 2.3.1 骨小梁樣品的制作19
• 2.3.2 掃描電子顯微鏡檢測(cè)骨與細(xì)胞界面的形貌19-20
• 2.3.3 原子力顯微鏡檢測(cè)骨與細(xì)胞界面的硬度20-21
• 2.3.4 數(shù)據(jù)分析21
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-22
• 2.4.1 骨與細(xì)胞界面的形貌21-22
• 2.4.2 骨與細(xì)胞界面的硬度22
• 2.5 分析討論22-23
• 2.6 小結(jié)23-24
• 3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)、鑒定24-30
• 3.1 引言24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞24
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 3.2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑25
• 3.2.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制25-26
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 3.3.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)26
• 3.3.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型鑒定26-27
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-28
• 3.4.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)觀察27-28
• 3.4.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型鑒定28
• 3.5 分析討論28-29
• 3.6 小結(jié)29-30
• 4 聚二甲基硅氧烷基底的制備及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同硬度和形貌基底上的增殖、形態(tài)與成骨分化30-54
• 4.1 引言30
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料30-33
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞30
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 4.2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑31-32
• 4.2.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制32-33
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法33-41
• 4.3.1 微機(jī)控制回彈力試驗(yàn)機(jī)測(cè)定聚二甲基硅氧烷的硬度33-34
• 4.3.2 聚二甲基硅氧烷基底的制備34
• 4.3.3 掃描電子顯微鏡檢測(cè)聚二甲基硅氧烷表面的脊槽結(jié)構(gòu)34
• 4.3.4 聚二甲基硅氧烷基底的表面處理34-35
• 4.3.5 細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖35-36
• 4.3.6 聚二甲基硅氧烷基底上細(xì)胞形態(tài)觀察36-37
• 4.3.7 骨鈣蛋白與Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光染色37
• 4.3.8 堿性磷酸酶活性檢測(cè)37-39
• 4.3.9 qRT-PCR檢測(cè)Runx2 mRNA的表達(dá)39-41
• 4.3.10 數(shù)據(jù)分析41
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-51
• 4.4.1 不同質(zhì)量比例混合184預(yù)聚物/184固化劑聚二甲基硅氧烷基底的硬度41-42
• 4.4.2 具有脊槽結(jié)構(gòu)硅片表面的形貌42
• 4.4.3 具有脊槽結(jié)構(gòu)聚二甲基硅氧烷基底的形貌42-43
• 4.4.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同硬度與形貌聚二甲基硅氧烷基底上的增殖43-44
• 4.4.5 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同硬度與形貌聚二甲基硅氧烷基底上的形態(tài)44-46
• 4.4.6 不同硬度與形貌聚二甲基硅氧烷基底上大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化差異46-51
• 4.5 分析討論51-52
• 4.6 小結(jié)52-54
• 5 全文總結(jié)及展望54-56
• 5.1 主要結(jié)論54
• 5.2 展望54-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 綜述62-73
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果73
• 攻讀學(xué)位期間獲獎(jiǎng)情況73-74
• 致謝74

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