本文關鍵詞：一種新型細胞壓力加載系統(tǒng)的研制及壓力對BMSCs生物學特性與軟骨向分化影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：顳頜關節(jié)（temporomandibualr joint,TMJ）作為人體內最復雜、精細的關節(jié)之一，具有運動靈活的特點以及負重的功能。它生長與改建的動力來自于下頜運動時其所承受的負荷，髁突軟骨既是TMJ的應力敏感與受力改建的重要區(qū)域，也是關節(jié)運動過程中不可或缺的重要組成部分。它雖然僅數(shù)毫米厚，卻具有非常高的抗壓硬度和彈性，并且能在關節(jié)運動過程中分散壓力。臨床上，由于炎癥、腫瘤、外傷和發(fā)育異常等多種原因造成的關節(jié)軟骨缺損或變性壞死很常見。但由于關節(jié)軟骨缺乏血液供應、細胞代謝緩慢，加之關節(jié)軟骨一般都需要持續(xù)在正常范圍內的力學刺激以維持其結構和功能的完整性，而TMJ在各個方向的運動過程中關節(jié)內都承受著一定的壓力，而且壓力性質從正壓到負壓比較復雜，壓力水平變動范圍也隨著下頜不同的運動方式與幅度而變化較大，因此對髁突軟骨而言，其所承受的復雜力學微環(huán)境成為TMJ軟骨改建與再生的重要物理條件。 在諸多的具有成軟骨潛能的干細胞中，骨髓間充質干細胞（Bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs）以來源廣泛的特點優(yōu)于骨膜源性干細胞、以更高成軟骨潛能的特點優(yōu)于脂肪干細胞、以純化相對簡便且不存在倫理學問題的特點優(yōu)于胚胎干細胞。因而，將BMSCs作為種子細胞與支架材料復合后移植到軟骨缺損部位或采用內源性再生的方法誘導內源性BMSCs歸巢而促進髁突軟骨改建與再生，被認為是現(xiàn)今最好的修復軟骨缺損的方法之一。但是其最大的缺陷在于所生成的軟骨細胞外基質力學性能不足。有研究表明力學刺激本身就可以誘導部分BMSCs向軟骨細胞分化，并形成基質成分更為豐富的軟骨組織。有學者提出，標準的BMSCs體外成軟骨分化過程必須加入力學刺激以抑制所形成軟骨的過度增生肥大，從而保證所生成軟骨組織的力學特性。因此要成功產生關節(jié)軟骨，還需對BMSCs的生長微環(huán)境進行合理的體外模擬和體內控制。由于下頜在運動時，其關節(jié)內壓力可以從張口時較大的負壓一直變化到閉口時較小的正壓乃至緊咬時較大的正壓，力值范圍變動之大、力學性質之復雜使得其髁突軟骨的改建與再生修復后的轉歸難以控制。到目前為止，還沒有細胞力學裝置能夠完成如此復雜力學微環(huán)境的模擬，因此在復雜而特殊的TMJ力學微環(huán)境中髁突軟骨再生修復的生物力學調控效應與機理至今不明。 針對上述問題，本研究擬在本課題組前期自行研制的可控液壓細胞加載裝置的基礎上，突破正-負壓力轉換、溫度控制等多個技術難關開發(fā)一種多功能動靜態(tài)體外細胞正-負壓加載系統(tǒng)，以實現(xiàn)在同一個細胞力學裝置上對靜態(tài)負壓、動態(tài)負壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓以及動態(tài)正-負壓等多種壓力作用方式的體外模擬；進一步通過對不同壓力條件作用下BMSCs從增殖活性、細胞周期到超微結構、細胞骨架、凋亡情況、乃至BMSCs的成軟骨向分化能力等多方面的檢測，揭示仿TMJ不同功能狀況的壓力微環(huán)境對基于BMSCs的關節(jié)軟骨再生的力學生物學效應，以期為今后關節(jié)軟骨組織工程修復的生物力學調控提供理論依據(jù)與研究基礎。課題主要分為以下兩大部分展開。 第一部分一種新型多功能體外細胞動靜態(tài)正-負壓加載系統(tǒng)的研制 該系統(tǒng)由細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、驅動控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)三部分組成，通過壓力控制系統(tǒng)對細胞培養(yǎng)箱內加載靜態(tài)或周期性變化的正壓、負壓或正-負壓，并作用于培養(yǎng)皿中的細胞，從而實現(xiàn)不同壓力作用條件對細胞影響的研究。參數(shù)設置為：壓力調節(jié)范圍-50~300KPa，動壓調節(jié)控制精度±5%，靜態(tài)負壓調節(jié)控制精度±1%，靜態(tài)正壓調節(jié)控制精度±3%，溫度36±2℃，加載的頻率為0.01Hz—0.1Hz。該裝置采用恒溫水槽與輔助加熱裝置聯(lián)合應用的方式克服不同性質與范圍壓力變化時的溫度補償，以維持細胞培養(yǎng)箱內的恒溫；采用壓縮泵和真空泵聯(lián)合使用的壓力驅動系統(tǒng)，以提供較大范圍的正壓和負壓調節(jié)；采用計算機軟件監(jiān)控下的控制面板，實時監(jiān)控培養(yǎng)箱的壓力變化軌跡、壓力波形曲線及溫度。同時，該裝置具有操作簡單、壓力控制精度較高、溫度控制穩(wěn)定、壓力作用模式種類多、壓力作用范圍寬、性能可靠等特點，除了本研究所涉及的BMSCs外，還適合對關節(jié)軟骨細胞、成骨細胞、牙周膜細胞等多種壓力相關細胞進行體外細胞力學研究。 第二部分壓力作用下骨髓間充質干細胞的力學生物學響應 本部分的實驗一，首先采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，并通過繪制細胞生長曲線，表面標志物和多向分化能力鑒定，鑒定證明所培養(yǎng)細胞確為間充質來源的干細胞。 本部分的實驗二，應用第一部分中自行研制開發(fā)的新型細胞體外壓力加載系統(tǒng)，采用五種不同性質的壓力對體外培養(yǎng)的BMSCs進行細胞力學加載，包括：靜態(tài)負壓（10KPa、-20KPa、-30KPa、-40KPa、-50KPa五種力值條件）、動態(tài)負壓（0~10KPa、0~20KPa、0~30KPa、0~40KPa、0~50KPa，0.1Hz五種力值條件）、靜態(tài)正壓（45KPa、90KPa、135KPa、180KPa四種力值條件）、動態(tài)正壓（0~45KPa、0~90KPa、0~135KPa、0~180KPa，，0.1Hz四種力值條件）、以及動態(tài)正-負壓（-20~45KPa、-20~90KPa、-20~135KPa、-20~180KPa、-40~45KPa、-40~90KPa、-40~135KPa、-40~180KPa，0.1Hz八種力值條件），上述共26組細胞每天以相應力學刺激條件加載1h、連續(xù)加載2天，對照組細胞則在培養(yǎng)裝置內培養(yǎng)不加壓相同時間。CCK-8進行細胞增殖活性檢測及流式細胞術進行細胞周期檢測，結果顯示：特定的壓力作用可促進BMSCs分裂與增殖，其中動壓促增殖效應強于靜壓，動壓中又以低負壓和高正壓促進效果更好，動態(tài)正-負壓條件下則以-40~135KPa范圍內的動壓為最佳促增殖條件。根據(jù)實驗二中所獲得的不同壓力條件對BMSCs增殖活性與細胞周期的影響，從五類26種不同壓力加載條件中選取具有代表性的五類12種壓力加載條件：靜態(tài)負壓（-20KPa、-40KPa）、動態(tài)負壓（0~20KPa、0~40KPa，0.1Hz）、靜態(tài)正壓（45KPa、90KPa）、動態(tài)正壓（0~45KPa、0~90KPa，0.1Hz）、以及動態(tài)正-負壓（-20~45KPa、-20~90KPa、--40~45KPa、-40~90KPa，0.1Hz），進行后續(xù)實驗的觀察。 實驗三中采用透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察不同壓力條件對BMSCs超微結構和細胞骨架的影響。結果顯示：低強度（-20KPa）靜態(tài)或動態(tài)負壓作用下，BMSCs表現(xiàn)出內質網(wǎng)擴張、微絨毛豐富等蛋白分泌旺盛的特征，而高強度（-40KPa）靜態(tài)或動態(tài)負壓作用下，細胞則出現(xiàn)早期凋亡的表征。低強度（45KPa）靜態(tài)或動態(tài)正壓作用下細胞內質網(wǎng)輕度擴張，線粒體嵴排列較整齊，核糖體豐富，微絨毛豐富，且細胞周圍可見膠原分泌。而高強度（90KPa）靜態(tài)或動態(tài)正壓作用下細胞出現(xiàn)凋亡特征，但同時伴隨細胞中分泌的基質增多，提示該水平壓力作用下細胞更新加速，凋亡細胞增多的同時細胞分化進程加快、分泌能力增強。細胞加載動態(tài)正-負壓刺激后，僅在-40~90KPa組觀察到細胞中核仁較大、內質網(wǎng)擴張、細胞活性較好，其余正-負壓組細胞觀察到不同程度細胞凋亡指征。F-actin熒光染色顯示，無論靜態(tài)或動態(tài)負壓還是靜態(tài)或動態(tài)正壓均可有效地促進F-actin表達及應力纖維的裝配，動態(tài)正-負壓作用下也可引起應力纖維的裝配，但F-actin染色強度低于動態(tài)正壓及動態(tài)靜壓組。 在實驗四中我們用流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果顯示：經(jīng)實驗二證實具有抑制細胞增殖作用的靜態(tài)負壓（-40KPa）以及動態(tài)正-負壓（-20~90KPa、-40~45KPa）組細胞凋亡量顯著增加，分析可能由于高強度的持續(xù)壓力超過了BMSCs的生理載荷，因此細胞發(fā)生了凋亡，而應力變化幅度較小的動態(tài)壓力可能因作用強度不足無法引起細胞增殖、凋亡等的生物學特性的改變。在本部分結果中，經(jīng)實驗二證實具有促細胞增殖作用的低強度動態(tài)負壓（0~-20KPa）、高強度靜、動態(tài)正壓（90KPa、0~90KPa）、以及特定范圍正-負壓（-40~90KPa）組細胞凋亡也有所增加，提示力學刺激下一定程度的細胞凋亡可能是細胞自身改建、調節(jié)的方式之一，該結果與在超微結構中所觀察到的變化趨勢相一致。 在實驗五中，我們采用Real-time PCR檢測靜態(tài)負壓、動態(tài)負壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓、動態(tài)正-負壓五類12種壓力條件刺激下BMSCs中成軟骨標志基因mRNA的表達量。結果顯示：低強度動態(tài)及靜態(tài)負壓（-20KPa、0~-20KPa）顯著促進BMSCs中Sox9及Aggrecan基因的表達，而高強度靜態(tài)及動態(tài)負壓（-40KPa、0~-40KPa）抑制成軟骨基因表達；高強度靜態(tài)或動態(tài)正壓力（90KPa、0~90KPa）顯著促進BMSCs中包括Sox9、Aggrecan以及II型膠原在內的所有成軟骨指標，而低強度靜態(tài)及動態(tài)正壓（45KPa、0~45KPa）表現(xiàn)出對Sox9基因的促進作用。動態(tài)正-負壓組中僅-40~90KPa壓力組表現(xiàn)出對包括Sox9、Aggrecan以及II型膠原在內的所有成軟骨指標的促進作用，而其余三種動態(tài)正-負壓刺激條件隨也表現(xiàn)出對Sox9和Aggrecan基因不同程度的刺激作用但并不能引起II型膠原基因的上調。橫向比較五類不同性質的壓力，以動態(tài)壓力的成軟骨促進作用好于靜態(tài)壓力，動態(tài)壓力中又以0~90KPa動態(tài)正壓促成軟骨效果最好，其次為-40~90KPa的動態(tài)正-負壓。 小結： 本課題自主創(chuàng)新成功研制出一種新型多功能體外細胞動靜態(tài)正-負壓加載系統(tǒng)，該裝置具有操作簡單、壓力控制精度較高、溫度控制穩(wěn)定、壓力作用模式種類多、壓力作用范圍寬、性能可靠等特點，在國內外首次實現(xiàn)在同一個細胞力學儀器上的靜態(tài)負壓、動態(tài)負壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓以及動態(tài)正-負壓等多種壓力作用方式的體外模擬。在此基礎上，課題組進一步通過對不同壓力條件作用下BMSCs從增殖活性、細胞周期到超微結構、細胞骨架、凋亡情況、乃至BMSCs的成軟骨基因的PCR檢測等多方面的分析，揭示了靜態(tài)負壓、動態(tài)負壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓以及動態(tài)正-負壓五類12種壓力條件在BMSCs的力學生物學響應，綜合增殖、凋亡、骨架、超微結構及軟骨向分化的檢測結果，我們發(fā)現(xiàn)在五類12種壓力條件中，低強度動態(tài)負壓（0~-20KPa）、高強度靜態(tài)及動態(tài)正壓（90KPa、0~90KPa）以及-40~90KPa動態(tài)正-負壓表現(xiàn)出明顯促BMSCs生物學活性的作用，但0~-20KPa動態(tài)負壓刺激不能促進II型膠原基因的上調、90KPa靜態(tài)正壓力在促進細胞增殖和軟骨向分化的同時細胞凋亡也十分活躍。因此，只有0~90KPa動態(tài)正壓和-40~90KPa動態(tài)正-負壓表現(xiàn)出促進增殖、促進細胞骨架重組、凋亡稍活躍、促進各種軟骨指標的上調等全面的正向促進作用，其中就促成軟骨基因上調方面，0~90KPa動態(tài)正壓力的效應又好于-40~90KPa動態(tài)正-負壓。由于TMJ活動中變化的關節(jié)內壓力使得髁突軟骨所處的力學微環(huán)境較復雜，本研究所揭示的不同性質壓力微環(huán)境對基于BMSCs的關節(jié)軟骨再生的力學生物學效應，有望為今后TMJ髁突軟骨組織工程修復的生物力學調控提供研究基礎。也可為關節(jié)軟骨細胞、成骨細胞、牙周膜細胞等多種壓力相關細胞進行體外細胞力學研究提供有益的借鑒。
【關鍵詞】：壓力 骨髓間充質干細胞 力學生物學 增殖 軟骨向分化
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R783.1
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-17
• 前言17-18
• 文獻回顧18-29
• 1. 顳頜關節(jié)力學特性的研究18-19
• 2. 髁突軟骨損傷治療的研究現(xiàn)狀19-21
• 3. 力學刺激對細胞生物學效應的研究現(xiàn)狀21-25
• 4. 細胞力學加載裝置的研究現(xiàn)狀25-29
• 第一部分 新型多功能體外細胞動靜態(tài)正-負壓加載系統(tǒng)的研制29-37
• 1 材料29-30
• 2 系統(tǒng)組成30-33
• 3 系統(tǒng)的工作原理33
• 4 系統(tǒng)的軟件設計33-35
• 5 討論35-37
• 第二部分 壓力作用下骨髓間充質干細胞的力學生物學響應37-75
• 實驗一 SD 大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定37-43
• 1 材料37-38
• 2 方法38-40
• 3 結果40-42
• 4 討論42-43
• 實驗二 不同壓力條件對 BMSCs 增殖活性的影響43-53
• 1 材料43
• 2 方法43-45
• 3 結果45-51
• 4 討論51-53
• 實驗三 不同壓力條件對 BMSCs 超微結構及細胞骨架的影響53-62
• 1 材料53
• 2 方法53-54
• 3 結果54-60
• 4 討論60-62
• 實驗四 不同壓力條件對 BMSCs 凋亡的影響62-68
• 1 材料62
• 2 方法62-63
• 3 結果63-66
• 4 討論66-68
• 實驗五 不同壓力條件下對 BMSCs 成軟骨向分化的影響68-75
• 1 材料68
• 2 方法68-69
• 3 結果69-73
• 4 討論73-75
• 小結75-77
• 參考文獻77-88
• 個人簡歷和研究成果88-89
• 致謝89

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：462381