本文關(guān)鍵詞：一種新型細(xì)胞壓力加載系統(tǒng)的研制及壓力對BMSCs生物學(xué)特性與軟骨向分化影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：顳頜關(guān)節(jié)（temporomandibualr joint,TMJ）作為人體內(nèi)最復(fù)雜、精細(xì)的關(guān)節(jié)之一，具有運(yùn)動靈活的特點(diǎn)以及負(fù)重的功能。它生長與改建的動力來自于下頜運(yùn)動時(shí)其所承受的負(fù)荷，髁突軟骨既是TMJ的應(yīng)力敏感與受力改建的重要區(qū)域，也是關(guān)節(jié)運(yùn)動過程中不可或缺的重要組成部分。它雖然僅數(shù)毫米厚，卻具有非常高的抗壓硬度和彈性，并且能在關(guān)節(jié)運(yùn)動過程中分散壓力。臨床上，由于炎癥、腫瘤、外傷和發(fā)育異常等多種原因造成的關(guān)節(jié)軟骨缺損或變性壞死很常見。但由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血液供應(yīng)、細(xì)胞代謝緩慢，加之關(guān)節(jié)軟骨一般都需要持續(xù)在正常范圍內(nèi)的力學(xué)刺激以維持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，而TMJ在各個(gè)方向的運(yùn)動過程中關(guān)節(jié)內(nèi)都承受著一定的壓力，而且壓力性質(zhì)從正壓到負(fù)壓比較復(fù)雜，壓力水平變動范圍也隨著下頜不同的運(yùn)動方式與幅度而變化較大，因此對髁突軟骨而言，其所承受的復(fù)雜力學(xué)微環(huán)境成為TMJ軟骨改建與再生的重要物理?xiàng)l件。 在諸多的具有成軟骨潛能的干細(xì)胞中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs）以來源廣泛的特點(diǎn)優(yōu)于骨膜源性干細(xì)胞、以更高成軟骨潛能的特點(diǎn)優(yōu)于脂肪干細(xì)胞、以純化相對簡便且不存在倫理學(xué)問題的特點(diǎn)優(yōu)于胚胎干細(xì)胞。因而，將BMSCs作為種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合后移植到軟骨缺損部位或采用內(nèi)源性再生的方法誘導(dǎo)內(nèi)源性BMSCs歸巢而促進(jìn)髁突軟骨改建與再生，被認(rèn)為是現(xiàn)今最好的修復(fù)軟骨缺損的方法之一。但是其最大的缺陷在于所生成的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)性能不足。有研究表明力學(xué)刺激本身就可以誘導(dǎo)部分BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，并形成基質(zhì)成分更為豐富的軟骨組織。有學(xué)者提出，標(biāo)準(zhǔn)的BMSCs體外成軟骨分化過程必須加入力學(xué)刺激以抑制所形成軟骨的過度增生肥大，從而保證所生成軟骨組織的力學(xué)特性。因此要成功產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨，還需對BMSCs的生長微環(huán)境進(jìn)行合理的體外模擬和體內(nèi)控制。由于下頜在運(yùn)動時(shí)，其關(guān)節(jié)內(nèi)壓力可以從張口時(shí)較大的負(fù)壓一直變化到閉口時(shí)較小的正壓乃至緊咬時(shí)較大的正壓，力值范圍變動之大、力學(xué)性質(zhì)之復(fù)雜使得其髁突軟骨的改建與再生修復(fù)后的轉(zhuǎn)歸難以控制。到目前為止，還沒有細(xì)胞力學(xué)裝置能夠完成如此復(fù)雜力學(xué)微環(huán)境的模擬，因此在復(fù)雜而特殊的TMJ力學(xué)微環(huán)境中髁突軟骨再生修復(fù)的生物力學(xué)調(diào)控效應(yīng)與機(jī)理至今不明。 針對上述問題，本研究擬在本課題組前期自行研制的可控液壓細(xì)胞加載裝置的基礎(chǔ)上，突破正-負(fù)壓力轉(zhuǎn)換、溫度控制等多個(gè)技術(shù)難關(guān)開發(fā)一種多功能動靜態(tài)體外細(xì)胞正-負(fù)壓加載系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)細(xì)胞力學(xué)裝置上對靜態(tài)負(fù)壓、動態(tài)負(fù)壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓以及動態(tài)正-負(fù)壓等多種壓力作用方式的體外模擬；進(jìn)一步通過對不同壓力條件作用下BMSCs從增殖活性、細(xì)胞周期到超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、凋亡情況、乃至BMSCs的成軟骨向分化能力等多方面的檢測，揭示仿TMJ不同功能狀況的壓力微環(huán)境對基于BMSCs的關(guān)節(jié)軟骨再生的力學(xué)生物學(xué)效應(yīng)，以期為今后關(guān)節(jié)軟骨組織工程修復(fù)的生物力學(xué)調(diào)控提供理論依據(jù)與研究基礎(chǔ)。課題主要分為以下兩大部分展開。 第一部分一種新型多功能體外細(xì)胞動靜態(tài)正-負(fù)壓加載系統(tǒng)的研制 該系統(tǒng)由細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、驅(qū)動控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)三部分組成，通過壓力控制系統(tǒng)對細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)加載靜態(tài)或周期性變化的正壓、負(fù)壓或正-負(fù)壓，并作用于培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)不同壓力作用條件對細(xì)胞影響的研究。參數(shù)設(shè)置為：壓力調(diào)節(jié)范圍-50~300KPa，動壓調(diào)節(jié)控制精度±5%，靜態(tài)負(fù)壓調(diào)節(jié)控制精度±1%，靜態(tài)正壓調(diào)節(jié)控制精度±3%，溫度36±2℃，加載的頻率為0.01Hz—0.1Hz。該裝置采用恒溫水槽與輔助加熱裝置聯(lián)合應(yīng)用的方式克服不同性質(zhì)與范圍壓力變化時(shí)的溫度補(bǔ)償，以維持細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)的恒溫；采用壓縮泵和真空泵聯(lián)合使用的壓力驅(qū)動系統(tǒng)，以提供較大范圍的正壓和負(fù)壓調(diào)節(jié)；采用計(jì)算機(jī)軟件監(jiān)控下的控制面板，實(shí)時(shí)監(jiān)控培養(yǎng)箱的壓力變化軌跡、壓力波形曲線及溫度。同時(shí)，該裝置具有操作簡單、壓力控制精度較高、溫度控制穩(wěn)定、壓力作用模式種類多、壓力作用范圍寬、性能可靠等特點(diǎn)，除了本研究所涉及的BMSCs外，還適合對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞等多種壓力相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞力學(xué)研究。 第二部分壓力作用下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng) 本部分的實(shí)驗(yàn)一，首先采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過繪制細(xì)胞生長曲線，表面標(biāo)志物和多向分化能力鑒定，鑒定證明所培養(yǎng)細(xì)胞確為間充質(zhì)來源的干細(xì)胞。 本部分的實(shí)驗(yàn)二，應(yīng)用第一部分中自行研制開發(fā)的新型細(xì)胞體外壓力加載系統(tǒng)，采用五種不同性質(zhì)的壓力對體外培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行細(xì)胞力學(xué)加載，包括：靜態(tài)負(fù)壓（10KPa、-20KPa、-30KPa、-40KPa、-50KPa五種力值條件）、動態(tài)負(fù)壓（0~10KPa、0~20KPa、0~30KPa、0~40KPa、0~50KPa，0.1Hz五種力值條件）、靜態(tài)正壓（45KPa、90KPa、135KPa、180KPa四種力值條件）、動態(tài)正壓（0~45KPa、0~90KPa、0~135KPa、0~180KPa，，0.1Hz四種力值條件）、以及動態(tài)正-負(fù)壓（-20~45KPa、-20~90KPa、-20~135KPa、-20~180KPa、-40~45KPa、-40~90KPa、-40~135KPa、-40~180KPa，0.1Hz八種力值條件），上述共26組細(xì)胞每天以相應(yīng)力學(xué)刺激條件加載1h、連續(xù)加載2天，對照組細(xì)胞則在培養(yǎng)裝置內(nèi)培養(yǎng)不加壓相同時(shí)間。CCK-8進(jìn)行細(xì)胞增殖活性檢測及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，結(jié)果顯示：特定的壓力作用可促進(jìn)BMSCs分裂與增殖，其中動壓促增殖效應(yīng)強(qiáng)于靜壓，動壓中又以低負(fù)壓和高正壓促進(jìn)效果更好，動態(tài)正-負(fù)壓條件下則以-40~135KPa范圍內(nèi)的動壓為最佳促增殖條件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)二中所獲得的不同壓力條件對BMSCs增殖活性與細(xì)胞周期的影響，從五類26種不同壓力加載條件中選取具有代表性的五類12種壓力加載條件：靜態(tài)負(fù)壓（-20KPa、-40KPa）、動態(tài)負(fù)壓（0~20KPa、0~40KPa，0.1Hz）、靜態(tài)正壓（45KPa、90KPa）、動態(tài)正壓（0~45KPa、0~90KPa，0.1Hz）、以及動態(tài)正-負(fù)壓（-20~45KPa、-20~90KPa、--40~45KPa、-40~90KPa，0.1Hz），進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀察。 實(shí)驗(yàn)三中采用透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察不同壓力條件對BMSCs超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的影響。結(jié)果顯示：低強(qiáng)度（-20KPa）靜態(tài)或動態(tài)負(fù)壓作用下，BMSCs表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、微絨毛豐富等蛋白分泌旺盛的特征，而高強(qiáng)度（-40KPa）靜態(tài)或動態(tài)負(fù)壓作用下，細(xì)胞則出現(xiàn)早期凋亡的表征。低強(qiáng)度（45KPa）靜態(tài)或動態(tài)正壓作用下細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體嵴排列較整齊，核糖體豐富，微絨毛豐富，且細(xì)胞周圍可見膠原分泌。而高強(qiáng)度（90KPa）靜態(tài)或動態(tài)正壓作用下細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征，但同時(shí)伴隨細(xì)胞中分泌的基質(zhì)增多，提示該水平壓力作用下細(xì)胞更新加速，凋亡細(xì)胞增多的同時(shí)細(xì)胞分化進(jìn)程加快、分泌能力增強(qiáng)。細(xì)胞加載動態(tài)正-負(fù)壓刺激后，僅在-40~90KPa組觀察到細(xì)胞中核仁較大、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞活性較好，其余正-負(fù)壓組細(xì)胞觀察到不同程度細(xì)胞凋亡指征。F-actin熒光染色顯示，無論靜態(tài)或動態(tài)負(fù)壓還是靜態(tài)或動態(tài)正壓均可有效地促進(jìn)F-actin表達(dá)及應(yīng)力纖維的裝配，動態(tài)正-負(fù)壓作用下也可引起應(yīng)力纖維的裝配，但F-actin染色強(qiáng)度低于動態(tài)正壓及動態(tài)靜壓組。 在實(shí)驗(yàn)四中我們用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示：經(jīng)實(shí)驗(yàn)二證實(shí)具有抑制細(xì)胞增殖作用的靜態(tài)負(fù)壓（-40KPa）以及動態(tài)正-負(fù)壓（-20~90KPa、-40~45KPa）組細(xì)胞凋亡量顯著增加，分析可能由于高強(qiáng)度的持續(xù)壓力超過了BMSCs的生理載荷，因此細(xì)胞發(fā)生了凋亡，而應(yīng)力變化幅度較小的動態(tài)壓力可能因作用強(qiáng)度不足無法引起細(xì)胞增殖、凋亡等的生物學(xué)特性的改變。在本部分結(jié)果中，經(jīng)實(shí)驗(yàn)二證實(shí)具有促細(xì)胞增殖作用的低強(qiáng)度動態(tài)負(fù)壓（0~-20KPa）、高強(qiáng)度靜、動態(tài)正壓（90KPa、0~90KPa）、以及特定范圍正-負(fù)壓（-40~90KPa）組細(xì)胞凋亡也有所增加，提示力學(xué)刺激下一定程度的細(xì)胞凋亡可能是細(xì)胞自身改建、調(diào)節(jié)的方式之一，該結(jié)果與在超微結(jié)構(gòu)中所觀察到的變化趨勢相一致。 在實(shí)驗(yàn)五中，我們采用Real-time PCR檢測靜態(tài)負(fù)壓、動態(tài)負(fù)壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓、動態(tài)正-負(fù)壓五類12種壓力條件刺激下BMSCs中成軟骨標(biāo)志基因mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示：低強(qiáng)度動態(tài)及靜態(tài)負(fù)壓（-20KPa、0~-20KPa）顯著促進(jìn)BMSCs中Sox9及Aggrecan基因的表達(dá)，而高強(qiáng)度靜態(tài)及動態(tài)負(fù)壓（-40KPa、0~-40KPa）抑制成軟骨基因表達(dá)；高強(qiáng)度靜態(tài)或動態(tài)正壓力（90KPa、0~90KPa）顯著促進(jìn)BMSCs中包括Sox9、Aggrecan以及II型膠原在內(nèi)的所有成軟骨指標(biāo)，而低強(qiáng)度靜態(tài)及動態(tài)正壓（45KPa、0~45KPa）表現(xiàn)出對Sox9基因的促進(jìn)作用。動態(tài)正-負(fù)壓組中僅-40~90KPa壓力組表現(xiàn)出對包括Sox9、Aggrecan以及II型膠原在內(nèi)的所有成軟骨指標(biāo)的促進(jìn)作用，而其余三種動態(tài)正-負(fù)壓刺激條件隨也表現(xiàn)出對Sox9和Aggrecan基因不同程度的刺激作用但并不能引起II型膠原基因的上調(diào)。橫向比較五類不同性質(zhì)的壓力，以動態(tài)壓力的成軟骨促進(jìn)作用好于靜態(tài)壓力，動態(tài)壓力中又以0~90KPa動態(tài)正壓促成軟骨效果最好，其次為-40~90KPa的動態(tài)正-負(fù)壓。 小結(jié)： 本課題自主創(chuàng)新成功研制出一種新型多功能體外細(xì)胞動靜態(tài)正-負(fù)壓加載系統(tǒng)，該裝置具有操作簡單、壓力控制精度較高、溫度控制穩(wěn)定、壓力作用模式種類多、壓力作用范圍寬、性能可靠等特點(diǎn)，在國內(nèi)外首次實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)細(xì)胞力學(xué)儀器上的靜態(tài)負(fù)壓、動態(tài)負(fù)壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓以及動態(tài)正-負(fù)壓等多種壓力作用方式的體外模擬。在此基礎(chǔ)上，課題組進(jìn)一步通過對不同壓力條件作用下BMSCs從增殖活性、細(xì)胞周期到超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、凋亡情況、乃至BMSCs的成軟骨基因的PCR檢測等多方面的分析，揭示了靜態(tài)負(fù)壓、動態(tài)負(fù)壓、靜態(tài)正壓、動態(tài)正壓以及動態(tài)正-負(fù)壓五類12種壓力條件在BMSCs的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)，綜合增殖、凋亡、骨架、超微結(jié)構(gòu)及軟骨向分化的檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在五類12種壓力條件中，低強(qiáng)度動態(tài)負(fù)壓（0~-20KPa）、高強(qiáng)度靜態(tài)及動態(tài)正壓（90KPa、0~90KPa）以及-40~90KPa動態(tài)正-負(fù)壓表現(xiàn)出明顯促BMSCs生物學(xué)活性的作用，但0~-20KPa動態(tài)負(fù)壓刺激不能促進(jìn)II型膠原基因的上調(diào)、90KPa靜態(tài)正壓力在促進(jìn)細(xì)胞增殖和軟骨向分化的同時(shí)細(xì)胞凋亡也十分活躍。因此，只有0~90KPa動態(tài)正壓和-40~90KPa動態(tài)正-負(fù)壓表現(xiàn)出促進(jìn)增殖、促進(jìn)細(xì)胞骨架重組、凋亡稍活躍、促進(jìn)各種軟骨指標(biāo)的上調(diào)等全面的正向促進(jìn)作用，其中就促成軟骨基因上調(diào)方面，0~90KPa動態(tài)正壓力的效應(yīng)又好于-40~90KPa動態(tài)正-負(fù)壓。由于TMJ活動中變化的關(guān)節(jié)內(nèi)壓力使得髁突軟骨所處的力學(xué)微環(huán)境較復(fù)雜，本研究所揭示的不同性質(zhì)壓力微環(huán)境對基于BMSCs的關(guān)節(jié)軟骨再生的力學(xué)生物學(xué)效應(yīng)，有望為今后TMJ髁突軟骨組織工程修復(fù)的生物力學(xué)調(diào)控提供研究基礎(chǔ)。也可為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞等多種壓力相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞力學(xué)研究提供有益的借鑒。
【關(guān)鍵詞】：壓力 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 力學(xué)生物學(xué) 增殖 軟骨向分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R783.1
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-17
• 前言17-18
• 文獻(xiàn)回顧18-29
• 1. 顳頜關(guān)節(jié)力學(xué)特性的研究18-19
• 2. 髁突軟骨損傷治療的研究現(xiàn)狀19-21
• 3. 力學(xué)刺激對細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究現(xiàn)狀21-25
• 4. 細(xì)胞力學(xué)加載裝置的研究現(xiàn)狀25-29
• 第一部分 新型多功能體外細(xì)胞動靜態(tài)正-負(fù)壓加載系統(tǒng)的研制29-37
• 1 材料29-30
• 2 系統(tǒng)組成30-33
• 3 系統(tǒng)的工作原理33
• 4 系統(tǒng)的軟件設(shè)計(jì)33-35
• 5 討論35-37
• 第二部分 壓力作用下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)37-75
• 實(shí)驗(yàn)一 SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定37-43
• 1 材料37-38
• 2 方法38-40
• 3 結(jié)果40-42
• 4 討論42-43
• 實(shí)驗(yàn)二 不同壓力條件對 BMSCs 增殖活性的影響43-53
• 1 材料43
• 2 方法43-45
• 3 結(jié)果45-51
• 4 討論51-53
• 實(shí)驗(yàn)三 不同壓力條件對 BMSCs 超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞骨架的影響53-62
• 1 材料53
• 2 方法53-54
• 3 結(jié)果54-60
• 4 討論60-62
• 實(shí)驗(yàn)四 不同壓力條件對 BMSCs 凋亡的影響62-68
• 1 材料62
• 2 方法62-63
• 3 結(jié)果63-66
• 4 討論66-68
• 實(shí)驗(yàn)五 不同壓力條件下對 BMSCs 成軟骨向分化的影響68-75
• 1 材料68
• 2 方法68-69
• 3 結(jié)果69-73
• 4 討論73-75
• 小結(jié)75-77
• 參考文獻(xiàn)77-88
• 個(gè)人簡歷和研究成果88-89
• 致謝89

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 彭庭莉,楊軍,周繼祥,楊彥春;不同張應(yīng)力對體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)和纖維型肌動蛋白改變的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年09期

2 戚孟春,胡靜,鄒淑娟,韓力赤,羅恩;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和顱骨成骨細(xì)胞在張應(yīng)力下細(xì)胞骨架的改變[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

3 趙紅斌;張西正;吳金輝;郭勇;毛雁;;不同應(yīng)變對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系細(xì)胞骨架影響的研究[J];激光生物學(xué)報(bào);2007年01期

4 張e

本文編號：462381