發(fā)布時間：2017-05-25 18:16

  本文關(guān)鍵詞：TGF-β1基因轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合蠶絲蛋白-殼聚糖支架構(gòu)建功能軟骨的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis）是嚴(yán)重影響人類生活的疾病之一，由于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)缺乏血液供應(yīng)，一旦損傷，自我修復(fù)能力極差，而且病情會隨著時間逐步進(jìn)展。隨著我國乃至全球老年人口的增加，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率處于上升趨勢，同時骨關(guān)節(jié)疾病開始趨于年輕化，而且人數(shù)還在不斷增加。目前關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療方法雖然給軟骨缺損修復(fù)帶來了新希望，但是仍存在不足之處，主要包括需要從供區(qū)取出骨、軟骨組織或在正常組織上鉆孔，給供區(qū)造成新的損傷，而且需要至少2次以上的手術(shù)，同時由于供體來源有限，不能完全滿足臨床需求，因此，尋求一種替代骨軟骨移植物是急需解決的問題。本工作在文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究的基礎(chǔ)上，以殼聚糖和蠶絲蛋白為原材料通過冷凍干燥法來制作支架，然后將TGF-β1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的BMSCs作為種子細(xì)胞種植在支架上構(gòu)建組織工程化培養(yǎng)模型，并自行分泌生長因子，通過自分泌和旁分泌作用，在微環(huán)境下誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。研究結(jié)果對修復(fù)骨軟骨缺損有重大的意義，也為治療骨關(guān)節(jié)炎提供一定的臨床參考。因此，研究工作對于相關(guān)骨軟骨疾病的治療與康復(fù)進(jìn)行了有意義的探索。 方法： 1采用密度梯度離心法分離大鼠BMSCs,并對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)及鑒定。研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，了解其一般生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。 2蠶絲蛋白-殼聚糖組織工程支架的制備：蠶絲蛋白與殼聚糖按不同比例制備三種蠶絲蛋白-殼聚糖支架，對制備的支架進(jìn)行傅里葉紅外光譜結(jié)構(gòu)分析；考察復(fù)合支架的密度、孔隙率、熱水溶失率、力學(xué)性能、吸水膨脹率、抑菌能力等理化性質(zhì)；支架接種細(xì)胞后用MTS法考察細(xì)胞在支架上培養(yǎng)1、3、5、7d的增殖情況；SEM掃描電鏡觀察各組支架的孔徑大小、形態(tài)及細(xì)胞在最優(yōu)支架上培養(yǎng)2、5d的黏附情況；HE染色觀察細(xì)胞在最優(yōu)支架上培養(yǎng)5、10d的形態(tài)及滲透生長情況。 3基因轉(zhuǎn)染及鑒定：取TGF-β1質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂板，并挑單克隆，用LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒、測序。通過脂質(zhì)體法將獲得的TGF-β1質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第三代BMSCs：具體操作步驟按照脂質(zhì)體lipofection2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測TGF-β1mRNA表達(dá)水平。 4組織工程化培養(yǎng)模型的建立：用0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染TGF-β1質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒48h后的第三代BMSCs及空白對照組的第三代BMSCs，含10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基終止消化，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以2×106/mL接種到支架上，每塊支架接種約20μL細(xì)胞懸液，構(gòu)建組織工程化培養(yǎng)模型。實(shí)驗(yàn)共分三組：A組（TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）、B組（空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）和C組（空白對照組）。 5組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA）法檢測培養(yǎng)液上清中TGF-β1蛋白的含量。 6組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別利用阿利新藍(lán)法測定培養(yǎng)液上清中酸性糖胺多糖的含量。 7組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)2周后行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測支架細(xì)胞復(fù)合體中Ⅱ型膠原、Sox9mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1采用密度梯度離心法可以成功分離大鼠BMSCs,可見原代細(xì)胞剛接種時散在分布，呈圓形，24h后有部分細(xì)胞貼壁。貼壁細(xì)胞呈長梭形或多角形，第3-7d，細(xì)胞融合生長，呈梭形且呈集落樣增殖，7-10d可以達(dá)到80-90%融合，傳代后細(xì)胞生長明顯加速，生長活躍，并呈典型的漩渦樣生長。隨著傳代次數(shù)的增加，可得到高純度的BMSCs。經(jīng)3次傳代后，細(xì)胞形態(tài)較為一致。 2取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，經(jīng)過成軟骨、成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后,分別采用天狼猩紅染色、甲苯胺藍(lán)染色、ALP染色及茜素紅染色來鑒定誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞表型。結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法提取的BMSCs具有多向分化潛能。 3傅里葉紅外光譜證明：殼聚糖由糖特征結(jié)構(gòu)β-1，4糖苷鍵相互連接而成，故各組在1154cm-1及897cm-1處出現(xiàn)了特征性吸收峰，對于CS-SF支架材料來說，隨著CS含量的增高，代表無規(guī)卷曲/α螺旋結(jié)構(gòu)的吸收峰1654cm-1和1540cm-1不斷減小，而對應(yīng)于1628cm-1和1516cm-1處相當(dāng)于β-折疊結(jié)構(gòu)的吸收峰不斷增大，表明CS的加入改性了SF的結(jié)構(gòu)，使α螺旋結(jié)構(gòu)/無規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；各組密度分別為0.18±0.03，0.20±0.01，0.18±0.04（g/ml）；孔隙率分別為87.36±2.15，77.82±1.37，72.22±1.37（%）；熱水溶失率分別為：0，0，3.12±1.26（%）；彈性模量分別為：8.35±2.64，15.50±1.64，12.55±3.37(KPa)；吸水膨脹率分別為：1528.52±194.63，1078.22±100.52，1320.05±179.97（%）；抑菌圈直徑分別為：18±1，22±2，20.33±1.53(mm)；SEM下觀察1組支架孔徑在50-250μm之間，孔徑大小較為一致，孔相通性好，其它兩組結(jié)構(gòu)紊亂，孔徑大小不一，孔相通性差；生長曲線結(jié)果示：1d時1組中活細(xì)胞數(shù)明顯高于2組(P0.01)，3d、5d和7d時，1組中活細(xì)胞數(shù)量明顯高于2組和3組(P0.01)；SEM可見細(xì)胞呈梭形黏附于支架上，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加周圍出現(xiàn)較多量細(xì)胞外基質(zhì)；HE染色發(fā)現(xiàn)BMSCs在培養(yǎng)初期沿著支架材料內(nèi)部空隙貼壁生長，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，貼壁細(xì)胞呈集落樣生長，可明顯看到細(xì)胞間連接；結(jié)果證實(shí)：CS-SF支架的細(xì)胞相容性良好，能促進(jìn)BMSCs的存活和黏附，可以為細(xì)胞提供一個開放的生長環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞向支架內(nèi)部生長，并保證足夠的營養(yǎng)和氣體交換。 4脂質(zhì)體介導(dǎo)的TGF-β1質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染大鼠第三代BMSCs,轉(zhuǎn)染48h后行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測TGF-β1mRNA的表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果表明A組TGF-β1mRNA的表達(dá)水平高于B組和C組（P0.01）。 5組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA）法檢測培養(yǎng)液上清中TGF-β1蛋白的含量，結(jié)果顯示：四個時點(diǎn)，A組的TGF-β1分泌量都高于B組和C組（P0.05），同時A組TGF-β1單日分泌量呈逐漸下降趨勢，B組和C組TGF-β1單日分泌量則始終呈低表達(dá)趨勢。 6組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別利用阿利新藍(lán)法測定培養(yǎng)液上清中酸性糖胺多糖的含量。結(jié)果顯示：3、6、12d三個時點(diǎn)，A組培養(yǎng)液上清中GAG含量明顯高于B組和C組（P0.01）。同時A組GAG單日分泌量呈逐漸上升趨勢，B組和C組GAG單日分泌量則始終呈低表達(dá)趨勢。證實(shí)A組細(xì)胞出現(xiàn)成軟骨分化趨勢。 7組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)2周后提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測支架細(xì)胞復(fù)合體中Ⅱ型膠原、Sox9mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：A組表達(dá)Ⅱ型膠原、Sox9mRNA，B組和C組則無Ⅱ型膠原和Sox9兩種軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志基因的表達(dá)。 結(jié)論： 1密度梯度離心法可以成功分離大鼠BMSCs，所分離的BMSCs具有多向分化潛能。 2蠶絲蛋白和殼聚糖均為天然生物材料，原料易得，生物相容性好，，本研究將蠶絲蛋白與殼聚糖復(fù)合，通過強(qiáng)烈的氫鍵和離子鍵作用，改善其理化性能，并開發(fā)出適合于軟骨組織工程領(lǐng)域的蠶絲蛋白-殼聚糖復(fù)合支架材料。 3脂質(zhì)體法成功將TGF-β1基因真核表達(dá)型質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，然后將轉(zhuǎn)染48h后的第三代BMSCs接種到支架上，構(gòu)建組織工程化培養(yǎng)模型。A組組織工程化培養(yǎng)模型培養(yǎng)兩周后，分別從多個方面證實(shí)了組織工程化培養(yǎng)模型的成軟骨能力。
【關(guān)鍵詞】：蠶絲蛋白 殼聚糖 軟骨組織工程 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 基因轉(zhuǎn)染 誘導(dǎo)分化
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R684.3;R318.08
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 英文縮寫13-15
• 前言15-16
• 材料與方法16-35
• 結(jié)果35-40
• 附圖40-54
• 附表54-56
• 討論56-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 綜述 細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)及其在骨軟骨組織工程中的應(yīng)用66-74
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 致謝74-75
• 個人簡歷75

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：TGF-β1基因轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合蠶絲蛋白-殼聚糖支架構(gòu)建功能軟骨的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：394606