發(fā)布時間：2017-05-24 13:11

  本文關(guān)鍵詞：裝載經(jīng)RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達腺病毒載體的絲素多孔支架及其促血管化作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：加快皮膚真皮再生支架的血管化速度,是提高支架的成活率、有效引導(dǎo)真皮再生、修復(fù)全層皮膚缺損的關(guān)鍵問題。VEGF165和Ang-1是兩種重要的促血管生長因子,聯(lián)合作用既有利于促進血管的生成,又可以使新生血管獲得穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。本文將RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達腺病毒載體裝載在多孔絲素支架內(nèi),研究RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達腺病毒對EA.hy926細胞的感染效率;研究裝載基因載體的生物活性絲素支架體外對血管內(nèi)皮細胞的感染以及對雞胚尿囊膜血管生成的促進作用。進一步,將裝載基因載體的絲素支架移植于大鼠的皮膚真皮缺損部位,研究支架內(nèi)目的基因的原位感染和表達,及其對血管生成、真皮再生的影響。首先,用p Ad.VEGF165-Ang-1和腺病毒骨架質(zhì)粒p Ad.RGD同源重組得到同源重組質(zhì)粒p Ad.RGD-VEGF165-Ang-1,將線性化的p Ad.RGD-VEGF165-Ang-1通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染到QBI-293A包裝細胞中得到重組腺病毒Ad.RGD-VEGF165-Ang-1。用感染復(fù)數(shù)分別為10、20、30、40、50、100、150的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926細胞,激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測結(jié)果表明,隨著感染復(fù)數(shù)的增大,熒光表達增強,感染效率增大,當感染復(fù)數(shù)為50時,感染效率達到81%。其次,用感染復(fù)數(shù)為50的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926細胞,培養(yǎng)1,3,5,7天。CCK-8檢測結(jié)果表明Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染細胞有助于促進EA.hy926細胞的增殖。ELISA檢測VEGF和Ang-1因子分泌水平,結(jié)果表明感染Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的細胞分泌的VEGF165和Ang-1的量顯著高于未感染對照組(p0.05),且在7天內(nèi),隨著時間的延長,這兩種生長因子的分泌量增大。將Ad.RGD-VEGF165-Ang-1裝載在絲素多孔支架內(nèi),掃描電鏡觀察結(jié)果表明腺病毒顆粒均勻的分布在支架內(nèi)的孔壁上。在裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架內(nèi)接種細胞,熒光顯微鏡觀察絲素多孔支架內(nèi)的腺病毒能夠感染接種的細胞,說明裝在絲素支架上的腺病毒能保持感染細胞的活性。將接種細胞的絲素支架用戊二醛固定,掃描電鏡觀察細胞在絲素支架內(nèi)的生長情況,可見細胞在支架表面能夠充分鋪展、增殖。雞胚尿囊膜實驗觀察結(jié)果表明,裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架具有良好的促血管化的能力。進一步,將裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架植入SD大鼠的皮膚真皮缺損部位。HE和Masson’s染色進行的組織學(xué)觀察結(jié)果說明,與未裝載病毒載體的支架相比,裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的多孔絲素支架移植于SD大鼠的全層皮膚缺損創(chuàng)面后,能顯著促進支架內(nèi)部微血管的生成,促進膠原纖維產(chǎn)生,促進真皮組織再生。免疫組化結(jié)果表明裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架移植于大鼠皮膚真皮缺損部位后,創(chuàng)面VEGF165和Ang-1的表達量明顯地高;且在14天時表達量到最高峰。CD31、PDGF的表達量都也比未裝載病毒載體的支架高,且都在14天時表達量最高。說明,一方面目的基因VEGF165和Ang-1的表達促進了絲素支架內(nèi)血管的形成;另一方面還刺激創(chuàng)面產(chǎn)生更多的PDGF,有利于創(chuàng)面組織再生。
【關(guān)鍵詞】：血管化 絲素支架 血管內(nèi)皮生長因子 血管生成素 腺病毒載體
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 引言10-19
• 1.1 皮膚真皮再生支架的血管化10
• 1.2 促進支架血管化的途徑10-13
• 1.3 基因傳遞載體13-16
• 1.4 絲素支架在皮膚組織工程中的應(yīng)用16-17
• 1.5 本文研究的目的和主要內(nèi)容17-19
• 第二章RGD修飾的VEGF165-Ang-1 雙基因共表達重組腺病毒的構(gòu)建及其對EA.hy926 細胞的感染19-36
• 2.1 材料和方法19-28
• 2.2 結(jié)果與討論28-35
• 2.2.1 同源重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建的鑒定28-30
• 2.2.2 同源重組腺病毒的包裝和擴增30-32
• 2.2.3 重組腺病毒的RT-PCR鑒定32-33
• 2.2.4 不同感染劑量的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 感染EA.hy926 細胞33-35
• 2.3 本章小結(jié)35-36
• 第三章 Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 裝載于絲素支架內(nèi)體外感染血管內(nèi)皮細胞36-50
• 3.1 材料和方法36-40
• 3.2 結(jié)果與討論40-49
• 3.2.1 CCK8 檢測細胞增殖40-41
• 3.2.2 細胞培養(yǎng)上清液中VEGF165 和Ang-1 的ELISA檢測分析41-43
• 3.2.3 裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 的絲素多孔支架材料的SEM觀察43-44
• 3.2.4 支架內(nèi)的病毒載體感染EA.hy926 細胞的熒光顯微鏡觀察44-46
• 3.2.5 EA.hy926 細胞在絲素支架內(nèi)生長的SEM觀察46-47
• 3.2.6 雞胚尿囊膜的熒光表達及雞胚尿囊膜血管形成的觀察47-49
• 3.3 本章結(jié)論49-50
• 第四章 裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 的絲素多孔支架促進真皮再生的動物實驗50-80
• 4.1 材料與方法50-55
• 4.2 結(jié)果與討論55-79
• 4.2.1 大體觀察55-57
• 4.2.2 組織學(xué)觀察57-64
• 4.2.3 免疫組化64-79
• 4.3 本章結(jié)論79-80
• 第五章 結(jié)語80-82
• 5.1 全文結(jié)論80-81
• 5.2 本文的主要研究結(jié)果81
• 5.3 本文的不足之處81
• 5.4 今后進一步的研究計劃81-82
• 參考文獻82-90
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文90-91
• 致謝91-92

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