本文關(guān)鍵詞：牛膠原蛋白三維載體支架的制備及其與人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生物相容性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：角膜是位于眼球最前端的一層透明薄膜組織,在保護(hù)眼球、提供屈光力和保障視功能方面發(fā)揮了重要功能。熱燙傷、化學(xué)燒傷、機(jī)械損傷以及病菌感染等所造成的角膜病,是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲眼病。雖然角膜移植是治療角膜病盲的唯一有效手段,但由于捐獻(xiàn)角膜嚴(yán)重匱乏,導(dǎo)致絕大多數(shù)患者無法通過角膜移植恢復(fù)視力,而體外構(gòu)建的組織工程角膜作為理想的捐獻(xiàn)角膜替代品,是目前解決供體角膜匱乏的根本途徑。在組織工程角膜的體外構(gòu)建研究中,載體支架起關(guān)鍵作用,能夠?yàn)榉N子細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐并起到模板作用以引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)。用于構(gòu)建組織工程角膜的支架材料主要有異種角膜基質(zhì)等天然材料、人工合成高分子材料以及膠原和殼聚糖等生物大分子復(fù)合材料。與其它支架材料相比,膠原在生物相容性、免疫原性、可降解性等方面均具有明顯的優(yōu)勢。鑒于重組人膠原蛋白價格昂貴等問題,在一定程度上限制了利用膠原蛋白制備組織工程角膜載體支架的研發(fā)和應(yīng)用。而牛膠原蛋白來源豐富,提純方法簡便且得率高,在膠原蛋白三維載體支架的制備和推廣應(yīng)用方面日益表現(xiàn)出良好的前景。但到目前為止,仍未見到有關(guān)提取和純化牛膠原蛋白以及利用牛膠原蛋白制備組織工程角膜載體支架及其生物相容性的研究報道。本文以牛肌腱為材料提取牛膠原蛋白,然后利用牛膠原蛋白(130 mg/mL),采用凍干法制成支架凍干片,再以化學(xué)交聯(lián)劑EDC/NHS進(jìn)行交聯(lián),然后對其理化性質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示交聯(lián)劑比例EDC:NHS=4.125:1時制備的支架表面平整,厚度均勻；光學(xué)透明度高,透光率為41.5%-89.6%(WL=300 nm-800 nm);含水量約83.66%士1.75%；機(jī)械性能較好：載體支架結(jié)構(gòu)較致密,且形成多孔的片層結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果顯示,該方法制備的牛膠原蛋白載體支架在光學(xué)透明度、含水量和組織結(jié)構(gòu)方面均與天然角膜相似,保證了后續(xù)探索實(shí)驗(yàn)的開展。本文對來源于本實(shí)驗(yàn)室自主建立的人角膜基質(zhì)細(xì)胞系的第68代人角膜基質(zhì)細(xì)胞(HCSC)進(jìn)行體外培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的HCSC呈現(xiàn)典型的纖維樣,增殖旺盛,群體倍增時間為39.03 h；細(xì)胞染色體組型正常；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HCSC標(biāo)志蛋白(波形蛋白)和功能蛋白(間隙連接蛋白43、整聯(lián)蛋白、乙醛脫氫酶3A1)均陽性表達(dá)：實(shí)時定量PCR顯示HCSC能夠正常表達(dá)生長相關(guān)因子(Kras、mTOR和STAT3)、增殖相關(guān)因子(p27、CDK2)以及標(biāo)志蛋白(vimentin)。綜合以上結(jié)果表明HCSC保持了HCSC的特性,且具有生長增殖的能力和發(fā)揮正常功能的潛力,可用于牛膠原蛋白載體支架生物相容性的相關(guān)研究。本文利用該HCSC對上述載體支架的生物相容性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示載體支架浸提液對HCSC無明顯毒性作用；將HCSC接種在載體支架上培養(yǎng)5d,細(xì)胞能黏附在支架上生長,且有少量細(xì)胞遷入到支架內(nèi)部,細(xì)胞能夠陽性表達(dá)標(biāo)志蛋白(波形蛋白)和功能蛋白(間隙連接蛋白43、整聯(lián)蛋白、乙醛脫氫酶3A1),以及生長相關(guān)因子(Kras、mTOR和STAT3)、增殖相關(guān)因子(p27、CDK2)和標(biāo)志蛋白(vimentin)。以上結(jié)果表明制備的牛膠原蛋白載體支架具有理想的生物相容性。綜上所述,本文利用牛膠原蛋白制備了角膜載體支架,該支架的理化性質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)與天然角膜相似,且具有理想的生物相容性。這些結(jié)果表明牛膠原蛋白作為組織工程角膜支架材料具有良好的應(yīng)用前景,同時也為組織工程角膜的體外構(gòu)建研究奠定了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：組織工程角膜 載體支架 牛膠原蛋白 人角膜基質(zhì)細(xì)胞 生物相容性
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-21
• 1 角膜的結(jié)構(gòu)與功能13-16
• 1.1 角膜結(jié)構(gòu)13-15
• 1.1.1 角膜上皮層13-14
• 1.1.2 角膜內(nèi)皮層14
• 1.1.3 角膜基質(zhì)層14-15
• 1.2 角膜功能15-16
• 1.2.1 保護(hù)功能15
• 1.2.2 光的傳播功能15-16
• 2 角膜組織工程概述16-21
• 2.1 角膜上皮層的構(gòu)建17-18
• 2.2 角膜基質(zhì)層的構(gòu)建18-19
• 2.3 角膜內(nèi)皮層的構(gòu)建19
• 2.4 種子細(xì)胞19-21
• 第二章 牛膠原蛋白載體支架的制備和鑒定21-33
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料21-24
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑21-22
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑21-22
• 1.3 主要溶液配制22-24
• 1.3.1 PBS緩沖液配制22
• 1.3.2 交聯(lián)劑22
• 1.3.3 D-Hanks平衡鹽溶液22
• 1.3.4 生理鹽水配制22-23
• 1.3.5 伊紅染液配制23
• 1.3.6 0.1 M的HCl溶液23
• 1.3.7 甲醛明膠溶液23
• 1.3.8 HE染色所需溶液23-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-27
• 2.1 牛膠原蛋白提取24
• 2.2 牛膠原蛋白電泳檢測24-25
• 2.3 牛膠原蛋白載體支架的制備25
• 2.4 牛膠原蛋白載體支架的檢測25-26
• 2.4.1 透明度觀察25
• 2.4.2 透光率檢測25
• 2.4.3 含水量25-26
• 2.4.4 機(jī)械性能檢測26
• 2.5 牛膠原蛋白載體支架組織結(jié)構(gòu)檢測26-27
• 2.5.1 牛膠原蛋白載體支架冰凍切片與HE染色26
• 2.5.2 超微結(jié)構(gòu)26-27
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-31
• 3.1 牛膠原蛋白電泳檢測結(jié)果27
• 3.2 牛膠原蛋白載體支架的理化性質(zhì)27-30
• 3.2.1 外觀觀察27-28
• 3.2.2 透光率28-29
• 3.2.3 含水量29
• 3.2.4 機(jī)械性能29-30
• 3.3 牛膠原蛋白載體支架的組織結(jié)構(gòu)30-31
• 3.3.1 牛膠原蛋白載體支架的HE染色結(jié)果30
• 3.3.2 超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果30-31
• 4 討論31-32
• 5 本章小結(jié)32-33
• 第三章 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定33-48
• 1 材料與用品33-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料33
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器33-34
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑34
• 1.4 主要溶液配制34-35
• 1.4.1 DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)液的配制34-35
• 1.4.2 D-Hanks平衡鹽溶液35
• 1.4.3 0.25 %胰蛋白酶35
• 1.4.4 磷酸緩沖液35
• 1.4.5 吉姆薩染液35
• 2 實(shí)驗(yàn)方法35-41
• 2.1 人角膜細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)35-36
• 2.2 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖特性分析36
• 2.3 人角膜細(xì)胞的核型分析36-37
• 2.4 人角膜基質(zhì)細(xì)胞免疫化學(xué)檢測37-38
• 2.5 HCSC實(shí)時熒光定量PCR檢測38-41
• 2.5.1 總RNA提取38-39
• 2.5.2 cDNA的合成39
• 2.5.3 PCR引物設(shè)計39-40
• 2.5.4 引物特異性驗(yàn)證40
• 2.5.5 Real-time PCR擴(kuò)增40-41
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 3.1 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及形態(tài)觀察41
• 3.2 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖特性分析41-42
• 3.3 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的染色體組型分析42-43
• 3.4 人角膜基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志及功能蛋白表達(dá)43
• 3.5 人角膜基質(zhì)細(xì)胞生長、增殖等相關(guān)因子表達(dá)情況43-44
• 3.5.1 提取得到的總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果43-44
• 3.5.2 引物特異性檢測44
• 4 討論44-46
• 5 本章小結(jié)46-48
• 第四章 牛膠原蛋白三維載體支架與人角膜基質(zhì)細(xì)胞48-63
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料48-51
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器48-49
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑49
• 1.4 主要溶液配制方法49-51
• 1.4.1 0.1 mol/L磷酸氫二鈉水溶液49-50
• 1.4.2 PBS緩沖液50
• 1.4.3 甲醛明膠溶液50
• 1.4.4 20 %蔗糖溶液50
• 1.4.5 伊紅-蘇木精染色所用溶液50-51
• 2 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 2.1 牛膠原蛋白載體支架的滅菌處理51
• 2.2 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的DiI標(biāo)記51
• 2.3 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的接種和體外培養(yǎng)51-52
• 2.4 膠原蛋白載體支架的生物相容性檢測52-55
• 2.4.1 載體支架浸提液對HCSC活力影響作用分析52-53
• 2.4.2 人角膜基質(zhì)細(xì)胞與支架復(fù)合物的DiI熒光觀察53
• 2.4.3 人角膜基質(zhì)細(xì)胞與載體支架復(fù)合物的HE染色53
• 2.4.4 人角膜基質(zhì)細(xì)胞與載體支架復(fù)合物的超微結(jié)構(gòu)觀察53
• 2.4.5 人角膜基質(zhì)細(xì)胞與載體支架復(fù)合物的免疫熒光檢測53-54
• 2.4.6 人角膜基質(zhì)細(xì)胞與載體支架復(fù)合物的實(shí)時定量PCR檢測54-55
• 3 結(jié)果55-61
• 3.1 浸提液法檢測結(jié)果55-57
• 3.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)評價55-56
• 3.1.2 增殖能力檢測結(jié)果56-57
• 3.2 HE染色與熒光觀察57-58
• 3.3 免疫組織化學(xué)檢測58
• 3.4 超微結(jié)構(gòu)觀察58-59
• 3.5 載體支架中HCSC生長和增殖相關(guān)因子表達(dá)59-61
• 3.5.1 總RNA檢測結(jié)果59
• 3.5.2 引物特異性檢測結(jié)果59-60
• 3.5.3 實(shí)時熒光定量PCR60-61
• 4 討論61-62
• 5 本章小結(jié)62-63
• 全文總結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 致謝69-70
• 個人簡歷70
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及專利70

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本文編號：382111