本文關(guān)鍵詞：不同納米表面形貌對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 生物體內(nèi)的無(wú)機(jī)礦物組織是通過(guò)復(fù)雜的生物礦化過(guò)程而形成,從材料科學(xué)的角度來(lái)看,其形成過(guò)程可以視為由納米尺度的結(jié)構(gòu)單元逐級(jí)組裝而構(gòu)建生成,骨、齒科修復(fù)材料植入人體組織后其表面類(lèi)骨礦物材料的形成、長(zhǎng)大及結(jié)構(gòu)演變過(guò)程是材料具有優(yōu)異適配性的核心問(wèn)題。研究類(lèi)骨礦物形成過(guò)程、基質(zhì)蛋白對(duì)類(lèi)骨礦物的分子識(shí)別機(jī)制、生物微環(huán)境對(duì)類(lèi)骨鈣磷礦物的精確調(diào)控機(jī)理,從一個(gè)側(cè)面為植入材料的生物適配理論提供基礎(chǔ),并為新型骨、齒科修復(fù)材料的功能化設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。 目前組織工程學(xué)及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理想結(jié)果是生物材料可以增強(qiáng)細(xì)胞分化,促進(jìn)局部自身修復(fù)。在臨床上目前應(yīng)用最廣泛的骨科金屬植入材料依然是鈦及其合金,其優(yōu)點(diǎn)是擁有良好的耐腐蝕性及生物相容性,但也因其自身的生物活性不高,缺乏與周?chē)M織的有效結(jié)合,導(dǎo)致了較低的骨整合能力。有研究指出,與生物活性較好的材料相比,其促進(jìn)骨整合的時(shí)間要晚幾個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間。甚至可以使得1.5%～2.5%的髖、膝關(guān)節(jié)置換患者存在因?yàn)楦腥緦?dǎo)致手術(shù)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。因此,人們希望在保留鈦及其合金原有優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上,通過(guò)不同的方式來(lái)提高它的生物活性,取得更滿(mǎn)意的臨床療效。 納米技術(shù)近年來(lái)已經(jīng)滲透到醫(yī)療行業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元(如晶�；蚩紫�)小到納米級(jí),其性質(zhì)就會(huì)發(fā)生重大改變,不僅改善了原來(lái)材料的性能,甚至可以使材料本身具有新的性能或效應(yīng)。使得它們?cè)诠鈱W(xué)、催化、熱學(xué)、光化學(xué)以及敏感特性等方面具有一系列獨(dú)特的新特性。已有大量研究表面納米表面可影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。Dalby等發(fā)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)可促進(jìn)人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。Sjostrom通過(guò)鋁模版構(gòu)建不同規(guī)格的納米棒,結(jié)果表明可以明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化。目前報(bào)道的已有的納米植入材料有納米陶瓷,納米纖維,納米復(fù)合物等。通過(guò)不同的方法,可以獲得不同表面形貌的納米化結(jié)構(gòu),而他們對(duì)細(xì)胞都具有不同程度的影響。有學(xué)者認(rèn)為,之所以會(huì)產(chǎn)生不同影響,主要是表面形貌通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白粘附及對(duì)細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)產(chǎn)生的。細(xì)胞表面的受體可以識(shí)別并結(jié)合特定的細(xì)胞外基質(zhì)中結(jié)合蛋白的形狀,并與材料相結(jié)合。不同的納米表面形貌可以對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中的整合蛋白產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用。這些整合蛋白受體與細(xì)胞骨架相互作用,可以影響細(xì)胞的形狀,增殖及分化等方面。近年來(lái),很多研究證明納米棒、納米管等多種納米化表面材料在對(duì)細(xì)胞的生物相容性調(diào)控方面優(yōu)于純鈦,不同長(zhǎng)度的納米棒及不同管徑的納米管都對(duì)細(xì)胞有不同程度的影響,這說(shuō)明不同的納米形貌對(duì)細(xì)胞的作用大相徑庭,而以往的研究中,更多的是以純鈦?zhàn)鳛閷?duì)照,較少有文獻(xiàn)報(bào)道不同納米形貌間對(duì)細(xì)胞的影響差別。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是近年來(lái)的研究熱點(diǎn),其在不同的誘導(dǎo)作用下可以向不同的分化方向,正是這種多向的分化功能,使得它成為組織工程中重要的種子細(xì)胞。已有研究證明利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以更好的修復(fù)自身組織損傷,其與納米化鈦合金材料的共同應(yīng)用已經(jīng)運(yùn)用于口腔科及整形外科的治療當(dāng)中。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿熱處理方法,通過(guò)調(diào)控溫度的高低制備出納米網(wǎng)、納米葉、納米針及納米線(xiàn)四種不同納米表面結(jié)構(gòu),通過(guò)與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng),觀察細(xì)胞形狀,對(duì)比細(xì)胞粘附、增殖及成骨礦化的指標(biāo)對(duì)比四種納米形貌對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性影響的區(qū)別,并發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生物活性更有利的表面形貌。 研究目的 1.利用堿熱處理方法,通過(guò)調(diào)控不同溫度,獲得四種不同的表面形貌納米化材料,對(duì)各組材料的特性予以分析。 2.體外培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,與各組材料共培養(yǎng),利用鈣黃綠素法對(duì)死活細(xì)胞進(jìn)行染色,檢測(cè)材料的生物安全性,為進(jìn)一步的生物活性研究奠定基礎(chǔ)。 3.將小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與各組材料分別共同培養(yǎng),利用掃描電鏡觀察不同的納米表面形貌對(duì)細(xì)胞形狀的影響。 4.依次檢測(cè)各組材料對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖能力的指標(biāo),對(duì)比發(fā)現(xiàn)各組材料對(duì)細(xì)胞生物相容性的不同作用效果。 5.檢測(cè)各組材料對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向成骨分化能力的影響,對(duì)比各組間的區(qū)別。 研究方法 1.利用堿熱處理法加工醫(yī)用鈦片,高溫高壓處理時(shí)分別將溫度調(diào)整為80℃,100℃,1200℃,140℃,依次制備出四種不同表面形貌的納米化材料,利用X射線(xiàn)衍射儀,分析其衍射圖譜及組成成分,同時(shí)應(yīng)用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察不同表面形貌的區(qū)別。 2.體外復(fù)蘇、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,將細(xì)胞與各組材料分別共培養(yǎng),利用鈣黃綠素法對(duì)死活細(xì)胞進(jìn)行染色,通過(guò)觀察細(xì)胞染色情況,并結(jié)合共培養(yǎng)后細(xì)胞增殖情況觀察各組材料對(duì)細(xì)胞的毒性反應(yīng),進(jìn)一步評(píng)估其生物安全性。 3.將小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與各組材料共培養(yǎng)24h,通過(guò)脫水、噴金等處理后利用掃描電鏡觀察各組材料表面粘附的細(xì)胞形態(tài),對(duì)比各組材料表面細(xì)胞形態(tài)的區(qū)別。 4.將四種材料與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)復(fù)合培養(yǎng),利用DAPI法研究細(xì)胞30min、60min及120min的在材料表面的早期黏附情況；采用MTT法檢測(cè)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在四組材料表面第1、3、5天增殖活力。對(duì)比不同種材料對(duì)細(xì)胞生物相容性的不同影響,進(jìn)一步評(píng)估四種材料的在生物相容性方面的差異。 5.利用免疫熒光法觀察各組材料表面粘附的細(xì)胞骨架形態(tài),觀察并對(duì)比不同納米化表面對(duì)細(xì)胞骨架的影響及差異；將小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與四組材料復(fù)合培養(yǎng)14天后,采用p-NPP法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量,用胞內(nèi)總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,觀察四組材料對(duì)MSCs細(xì)胞的成骨分化的影響；MSCs細(xì)胞與四組材料復(fù)合培養(yǎng)21天后進(jìn)行酋素紅染色后,利用氯化十六烷吡啶溶解鈣結(jié)節(jié)后定量分析四種材料對(duì)MSCs礦化的影響。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計(jì)方差分析、One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩兩比較采用LSD法。方差不齊時(shí),采用Dunnetts T3比較。α=0.05,P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.利用堿熱處理法加工生物醫(yī)用鈦片,通過(guò)調(diào)控加工過(guò)程中的溫度,分別在鈦片表面獲得了四種不同的納米化形貌的材料,通過(guò)掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)溫度從低到高分別獲得了納米網(wǎng)、納米葉、納米針及納米線(xiàn)四種不同的納米表面形貌。能譜分析結(jié)果顯示四種納米化表面材料的表面元素組成及元素的比例,結(jié)果提示四種材料表面組成一樣,都完全是Ti元素。 2.利用鈣黃綠素法對(duì)復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行染色,結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)視野下所觀察到的四種材料表面的細(xì)胞絕大部分都被染色為代表活細(xì)胞的綠色熒光,說(shuō)明各組材料均沒(méi)有細(xì)胞毒性,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。 3.通過(guò)掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn),納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞形態(tài)具有最好的誘導(dǎo)性,表面粘附的細(xì)胞與材料結(jié)合的最緊密,有板狀突起伸出,納米葉狀結(jié)構(gòu)表面細(xì)胞形態(tài)較好,納米針及納米線(xiàn)結(jié)構(gòu)表面細(xì)胞與材料貼合不夠緊密,細(xì)胞形態(tài)較細(xì)長(zhǎng)。四種材料對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響的順序依次為：納米網(wǎng)納米葉納米針納米線(xiàn)。 4. MSCs在不同表面上30min,60min及120min的黏附結(jié)果表明：四組材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)30min后,四組材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；復(fù)合培養(yǎng)60min后,各組材料表面黏附的細(xì)胞明顯較30min多,納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面黏附的細(xì)胞數(shù)量均較其余三組材料多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),納米網(wǎng)納米葉納米針納米線(xiàn)。復(fù)合培養(yǎng)120min后,各組材料表面黏附的細(xì)胞明顯較30min和60min多,納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面黏附的細(xì)胞均較其余三組材料多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),納米網(wǎng)納米葉納米針納米線(xiàn)。 5. MSCs細(xì)胞與四種材料復(fù)合培養(yǎng)后,在第1天,3天和5天的細(xì)胞增殖活力比較結(jié)果表明：各組材料的細(xì)胞生殖活力有顯著性差異(P0.01),每組材料的OD值隨著時(shí)間而增加,符合細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。細(xì)胞培養(yǎng)1天后,四組材料的OD值相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；培養(yǎng)3天后,納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面的OD值高于其余三組材料,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0,05)；培養(yǎng)5天后,納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面的OD值仍然高于其余三組材料,并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面的增殖活力均其余三中納米形貌強(qiáng)。其次是納米葉狀結(jié)構(gòu)組,納米針狀結(jié)構(gòu)組次之,納米線(xiàn)狀結(jié)構(gòu)組材料的細(xì)胞增殖活力最小。 6.細(xì)胞與材料共培養(yǎng)24h后利用TRITC染色在正置熒光顯微鏡下觀察到的細(xì)胞骨架情況。與掃描電鏡結(jié)果相似的是,80℃下納米網(wǎng)狀材料表面細(xì)胞較其他組鋪展的面積較大,其他組,尤其是納米針及納米線(xiàn)組材料表面細(xì)胞雖有絲狀偽足突出,但整體形態(tài)較細(xì)長(zhǎng),或?yàn)椴灰?guī)則形。 7.ALP檢測(cè)結(jié)果顯示,培養(yǎng)14天后MSCs細(xì)胞在納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面的ALP活性高于對(duì)其余三種納米化表面,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其余三種材料ALP活性的比較：納米葉納米針納米線(xiàn)。 8.茜素紅染色法檢測(cè)MSCs細(xì)胞在不同試樣上培養(yǎng)21后的礦化程度,通過(guò)溶解鈣結(jié)節(jié)后定量分析的結(jié)果表明：納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面材料的礦化程度最高,較其余三種納米形貌有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.本研究中,通過(guò)調(diào)控堿熱處理法中高溫高壓處理時(shí)的溫度可以獲得不同的納米化表面形貌,在工藝及材料制備方面均有一定的創(chuàng)新性。 2.利用鈣黃綠素染色法證明了四種不同納米化表面形貌的材料均沒(méi)有細(xì)胞毒性,對(duì)該批納米化表面材料后續(xù)的生物相容性研究有重要的參考意義,也證明了通過(guò)堿熱處理法制備的表面納米化材料可以作為一種安全的植入性材料。 3.掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以更好的調(diào)控表面粘附的細(xì)胞形態(tài),并與細(xì)胞結(jié)合的更為緊密,說(shuō)明與另外三個(gè)表面形貌相比,納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)方面更具有優(yōu)勢(shì)。 4.細(xì)胞粘附、增殖結(jié)果證明納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物相容性的調(diào)節(jié)更具有優(yōu)勢(shì),納米葉、納米針及納米線(xiàn)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用依次減弱。 5.納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨礦化能力的調(diào)節(jié)更具有優(yōu)勢(shì),納米葉、納米針及納米線(xiàn)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用依次減弱。
【關(guān)鍵詞】：鈦 納米形貌 納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R687;R318.08
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-22
• 參考文獻(xiàn)19-22
• 第一章 材料的制備22-30
• 1 引言22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑23-24
• 3 實(shí)驗(yàn)方法24
• 4 結(jié)果24-26
• 5 討論26-27
• 6 小結(jié)27
• 參考文獻(xiàn)27-30
• 第二章 生物相容性的研究30-45
• 1 引言30-31
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑31-32
• 3 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 4 結(jié)果34-39
• 5 討論39-41
• 6 小結(jié)41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 第三章 成骨礦化實(shí)驗(yàn)45-56
• 1 前言45
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑45-46
• 3 實(shí)驗(yàn)方法46-47
• 4 結(jié)果47-50
• 5 討論50-53
• 6 小結(jié)53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 全文小結(jié)56-57
• 綜述57-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 致謝63-64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張駿;章慶國(guó);張嬌;;新型多孔雙相磷酸鈣支架與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相容性的體外實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2007年05期

  本文關(guān)鍵詞：不同納米表面形貌對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：381808