發(fā)布時間：2017-05-11 03:16

  本文關鍵詞：Lysine-cyclic RGD肽的設計及其運用于選擇性細胞滯留技術的應用基礎研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:理想的骨修復材料一直是骨外科的亟需品,然而目前的研究遭遇重重障礙,最具希望的骨組織工程也由于其種子細胞、支架材料和構建策略三大要素分別面臨諸多難題而致使其發(fā)展應用遭遇瓶頸。選擇性細胞滯留技術是傳統(tǒng)骨組織工程在構建策略上的一種改良手段,這種改良不僅可以突破傳統(tǒng)骨組織工程在構建策略上的關鍵性難題,并且由于采用自體骨髓的細胞成分作為即用型種子細胞,若策略得當,可同時解決傳統(tǒng)骨組織工程種子細胞在擴增周期、潛在致瘤性、免疫原性以及倫理學等方面諸多棘手的難題,這樣一來,支架材料的性能便成為了選擇性細胞滯留技術最為關鍵的決定因素。由于選擇性細胞滯留技術旨在盡量縮短構建時間以滿足臨床上對骨修復材料隨取隨用的要求,如此其要求的支架材料需要在性能上兼顧生物相容性、骨誘導性和快速的細胞粘附能力�；谝陨媳尘�,我們設想將成熟的促粘修飾物賴氨酸序列與具備特異性粘附能力和成骨誘導能力的RGD序列相結合,設計制備出Lysine-cyclic RGD(Lc RGD)肽,以物理電荷和生物配基相結合的方式協(xié)調非特異性粘附與特異性粘附,并在提高選擇性細胞滯留技術中支架材料對骨髓中細胞快速粘附能力的同時兼顧成骨誘導能力。方法:(1)查閱文獻,根據(jù)對合成物目標性能的實際要求,選用了具備較長半衰期、較好細胞粘附性并兼顧對MSCs成骨誘導性能的c(RGDf K)環(huán)五肽作為主體結構,再加上20K的賴氨酸序列以增強其非特異性粘附能力,最終課題組設計了LcRGD肽的結構,并以固態(tài)合成法和HPLC法等進行了制備、純化和驗證,以LcRGD肽對DBM進行了修飾并以激光共聚焦顯微鏡、環(huán)境掃描電鏡、能譜分析等方法驗證了修飾的有效性和穩(wěn)定性。(2)以離心細胞粘附實驗、CCK-8法、Western Blot、qPCR、堿性磷酸酶活性檢測等方法在體外檢測了LcRGD肽對間充質干細胞的粘附性能和成骨誘導能力。(3)以流式細胞儀、裸鼠股骨旁成骨實驗、影像學方法和病理學方法檢測了DBM/LcRGD支架材料對骨髓中有核細胞的粘附能力和體內(nèi)成骨能力。結果:(1)課題組成功設計和獲取了高純度的Lc RGD肽,環(huán)境掃描電鏡觀察到經(jīng)LcRGD肽修飾的DBM表面粗糙度有所提高,能譜分析亦顯示Lc RGD肽被成功地修飾于DBM表面。以帶FITC熒光的LcRGD肽修飾DBM后以激光共聚焦顯微鏡進行三維重建,證實了修飾的有效性,隨后將DBM/LcRGD-FITC支架材料以PBS緩沖液進行高載荷的模擬富集后再次以激光共聚焦顯微鏡進行三維重建,結果顯示LcRGD-FITC肽經(jīng)過較高強度的沖刷后仍然較為穩(wěn)定地修飾于DBM表面。(2)離心細胞粘附實驗結果顯示,相對于普通cRGD肽修飾的蓋玻片和未經(jīng)修飾的蓋玻片,Lc RGD肽修飾的蓋玻片對體外培養(yǎng)的間充質干細胞在早期便具有更強的粘附能力。CCK-8實驗證實了以MSCs細胞懸液模擬選擇性細胞滯留技術后,相對于DBM/cRGD和DBM支架材料,DBM/LcRGD支架材料滯留了更多MSCs,并且MSCs在DBM/LcRGD支架材料上的增殖最先到達峰頂密度。將以MSCs細胞懸液模擬選擇性細胞滯留技術后DBM/LcRGD、DBM/c RGD和DBM支架材料以成骨誘導培養(yǎng)基進行誘導后以q PCR、WesternBlot和堿性磷酸酶活性檢測試劑盒進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)DBM/LcRGD組具有更高的Runx2、ALP、OPN和OCN的基因表達水平和蛋白表達水平,以上結果表明LcRGD肽具有更好的誘導MSCs成骨分化的能力。(3)以選擇性細胞滯留技術采用健康成人骨髓對DBM/LcRGD、DBM/c RGD和DBM支架材料進行富集,流式細胞儀結果顯示DBM/LcRGD組對骨髓中有核細胞、單核細胞、CD90+/CD105+雙陽性細胞以及CD34+細胞的富集效率顯著高于對照組并展現(xiàn)出了一定的靶向粘附能力。以裸鼠股骨旁成骨實驗對DBM/Lc RGD和DBM支架材料進行體內(nèi)實驗觀察,影像學和病理學方法均顯示DBM/LcRGD組具有更好的體內(nèi)成骨能力。結論:以設計制備的Lc RGD肽修飾DBM所得的DBM/LcRGD支架材料具有良好的生物相容性、細胞粘附能力和成骨誘導性能,在運用于選擇性細胞滯留技術時其對骨髓中細胞的粘附滯留能力較好并展現(xiàn)出一定的靶向粘附能力,最終亦展現(xiàn)了較好的體內(nèi)成骨能力。作為運用于骨組織工程的支架材料修飾物,LcRGD肽尤其適用于選擇性細胞滯留技術并具有良好的實際應用前景。
【關鍵詞】：組織工程 選擇性細胞滯留技術 生物材料 合成肽 RGD肽
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08;R687
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-8
• 中文摘要8-10
• 第一章 前言10-13
• 第二章 Lysine-cyclic RGD肽的設計及DBM/Lysine-cyclic RGD支架材料的制備13-22
• 2.1 材料與方法13-16
• 2.2 結果16-21
• 2.3 討論21-22
• 第三章 Lysine-cyclic RGD肽對間充質干細胞粘附、增殖及成骨分化的影響22-39
• 3.1 材料與方法22-33
• 3.2 結果33-37
• 3.3 討論37-39
• 第四章 DBM/Lysine-cyclic RGD在選擇性細胞滯留技術中的應用39-49
• 4.1 材料與方法39-43
• 4.2 結果43-47
• 4.3 討論47-49
• 全文總結49-50
• 參考文獻50-54
• 文獻綜述 RGD序列肽的生物學效應及其應用54-60
• 參考文獻57-60
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況60-61
• 致謝61

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本文編號：356126