本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)瓶中組織工程骨軟骨復(fù)合物的動(dòng)態(tài)構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：由關(guān)節(jié)退行性疾病和創(chuàng)傷等原因引起的骨軟骨損傷病例日益增多,軟骨組織本身修復(fù)水平有限,臨床現(xiàn)有的修復(fù)軟骨損傷及創(chuàng)傷的方法,并不能完全恢復(fù)軟骨組織的功能。組織工程骨軟骨的迅速發(fā)展為修復(fù)臨床軟骨大面積的損傷帶來(lái)了新希望,其核心除了構(gòu)建細(xì)胞-支架的復(fù)合體外,體外培養(yǎng)環(huán)境也極為重要,傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)的方式為靜態(tài)培養(yǎng),但是這種方式在組織超過(guò)一定厚度時(shí),氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等擴(kuò)散會(huì)受到限制,阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提供及代謝廢物的排出,這樣會(huì)影響支架內(nèi)細(xì)胞的增殖及分化,基于此利用生物反應(yīng)器的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)受到了越來(lái)越多研究者的青睞。本研究采用經(jīng)脫脂、脫細(xì)胞等處理后的松質(zhì)骨支架作為骨仿生支架,利用殼聚糖與陰離子聚合體交聯(lián)的特性,和明膠混合,通過(guò)冷凍干燥致孔法,制備殼聚糖/明膠多孔復(fù)合支架作為軟骨支架材料,接種人脂肪干細(xì)胞(Human Adipose-derived stem cells, hADSCs)后,分別于成骨誘導(dǎo)基及軟骨誘導(dǎo)基培養(yǎng),構(gòu)建組織工程骨及組織工程軟骨,待培養(yǎng)兩周后,采用縫合的方式將兩部分結(jié)合,置于轉(zhuǎn)瓶動(dòng)態(tài)培養(yǎng),以盡快完成體外骨軟骨的動(dòng)態(tài)構(gòu)建。 脫細(xì)胞松質(zhì)骨及殼聚糖/明膠水凝膠支架的制備及其物理性質(zhì)：將豬骨清洗后,經(jīng)甲醇/氯仿脫脂,脫氧膽酸鈉脫細(xì)胞處理及H202脫蛋白后,制得脫細(xì)胞松質(zhì)骨支架。將2%殼聚糖醋酸溶液與明膠溶液以質(zhì)量比3：1混合,冷凍干燥后置于碳化二亞胺/羥基琥珀酰胺/嗎啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)交聯(lián)液中交聯(lián)6h,加入Na2HPO4溶液中和支架中的醋酸2h,再次冷凍干燥得到交聯(lián)后的水凝膠支架。然后將支架切成5mm×5mm×5mm小塊,掃描電鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM)下觀察骨及軟骨支架表面微觀形貌,萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)測(cè)定松質(zhì)骨及水凝膠的彈性模量,采用比重瓶法檢測(cè)了水凝膠支架的孔隙率,同時(shí)考察了支架的吸水率,紅外檢測(cè)儀分析松質(zhì)骨的組成成分。結(jié)果表明：松質(zhì)骨支架的平均孔徑為284.5±83.62μm,彈性模量為41.27±15.63MPa,紅外(Infrared Radiation,IR)檢測(cè)表明支架仍保留了羥基磷灰石等無(wú)機(jī)成分及少量蛋白質(zhì),與人骨的天然成分相同,具有良好的組織親和性和結(jié)合力。殼聚糖/明膠支架的平均孔徑為118.25±19.51μm,孔隙率為82.60±2.34%,吸水率為361.28±0.47%,彈性模量為61.2±0.16KPa。兩種支架選材具有良好的生物相容性和物理性能,適于選作骨軟骨構(gòu)建物的支撐材料。 人源脂肪干細(xì)胞的分離,培養(yǎng)及成骨,成軟骨誘導(dǎo)：經(jīng)胰酶法分離獲取脂肪干細(xì)胞,然后繼續(xù)培養(yǎng),傳代。取第5代hADSCs于成骨及軟骨誘導(dǎo)基中培養(yǎng),考察其這兩方向的分化潛能。結(jié)果表明：細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng),增殖速度快,5天即可傳代一次。hADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7天后,堿性磷酸酶陽(yáng)性表達(dá),誘導(dǎo)28天后,von-Kossa染色,染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌了大量鈣結(jié)節(jié)。ADSCs經(jīng)軟骨誘導(dǎo)基培養(yǎng)7,14天,經(jīng)甲苯胺藍(lán)及蕃紅花O染色后,可見(jiàn)胞漿及周圍粘液有大量異染性基質(zhì)。以上各種檢測(cè)結(jié)果證明hADSCs可向成骨,軟骨細(xì)胞分化,適于作為組織工程骨軟骨構(gòu)建的種子細(xì)胞。 細(xì)胞-松質(zhì)骨復(fù)合體的構(gòu)建及支架中細(xì)胞生長(zhǎng)及基質(zhì)分泌情況：將P7-hADSCs以106cells/mL密度接種于松質(zhì)骨支架內(nèi)部,每個(gè)支架40μL,正反兩面,接種細(xì)胞后的支架置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后,在孔板中添加足量成骨誘導(dǎo)基,繼續(xù)培養(yǎng),將一半組織構(gòu)建物移入轉(zhuǎn)瓶中,作為動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)組Ⅰ組,轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)速為40rpm,剩余復(fù)合物及單純松質(zhì)骨移入培養(yǎng)瓶中靜態(tài)培養(yǎng)分別作為對(duì)照組Ⅱ組及空白組Ⅲ組,ALP定性及定量試劑盒檢測(cè)了支架中細(xì)胞骨向分化能力,Dead/Live熒光染色定性考察了動(dòng)靜態(tài)環(huán)境下細(xì)胞在松質(zhì)骨支架中的生長(zhǎng)存活情況,葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)量了細(xì)胞的代謝情況,SEM觀察脫細(xì)胞松質(zhì)骨支架中細(xì)胞貼附及胞外基質(zhì)的分泌情況。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞骨向分化能力要稍高,Dead/Live結(jié)果表明動(dòng)態(tài)環(huán)境下細(xì)胞分布及生長(zhǎng)狀況更好一些,掃描電鏡表明細(xì)胞分泌基質(zhì)更多,轉(zhuǎn)瓶動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可以較快完成組織工程骨的構(gòu)建。 細(xì)胞-水凝膠復(fù)合體的構(gòu)建及支架中細(xì)胞生長(zhǎng)及基質(zhì)分泌情況：與組織工程骨的構(gòu)建方式一樣,將其中20個(gè)細(xì)胞支架復(fù)合物作為靜態(tài)對(duì)照組Ⅱ,另外20個(gè)細(xì)胞-水凝膠支架轉(zhuǎn)移到制作的不銹鋼架的鉑絲上,置于轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng),作為動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)組Ⅰ。甲苯胺藍(lán)及蕃紅花O檢測(cè)支架中細(xì)胞軟骨分化能力,Dead/Live熒光染色觀察動(dòng)靜態(tài)環(huán)境下細(xì)胞在水凝膠支架中的生長(zhǎng)情況,葡萄糖及乳酸試劑盒測(cè)量了細(xì)胞的代謝情況,SEM觀察水凝膠支架上細(xì)胞貼附及胞外基質(zhì)的分泌情況。結(jié)果表明：動(dòng)態(tài)環(huán)境促進(jìn)了糖胺多糖的表達(dá)及細(xì)胞基質(zhì)的分泌,細(xì)胞增殖更明顯。 骨軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建及動(dòng)靜態(tài)培養(yǎng)：按照構(gòu)建組織工程骨及軟骨的方法,將P7-hADSCs以107cells/mL密度分別接種松質(zhì)骨及水凝膠支架中,分別添加足量成骨誘導(dǎo)基及軟骨誘導(dǎo)基中培養(yǎng)兩周后,將兩部分用線縫合一起,構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合物。其中,一半移入轉(zhuǎn)瓶動(dòng)態(tài)培養(yǎng),另外一半置于培養(yǎng)瓶中靜態(tài)培養(yǎng)分別作為實(shí)驗(yàn)組Ⅰ組和對(duì)照組Ⅱ組,一定時(shí)間內(nèi),進(jìn)行相關(guān)方面檢測(cè)。激光共聚焦顯微鏡考察動(dòng)靜態(tài)組細(xì)胞在各層支架的分布,SEM考察了復(fù)合支架界面、軟骨及骨部分中細(xì)胞及其基質(zhì)分泌情況。結(jié)果表明：兩組復(fù)合物連接較緊密,Calcein染色表明動(dòng)態(tài)組細(xì)胞存活較多且分布更均勻,SEM結(jié)果表明兩組界面處及工程骨部分細(xì)胞及基質(zhì)分泌情況差別不大,動(dòng)態(tài)組在工程軟骨部分有更多的細(xì)胞成團(tuán)狀在孔壁伸展,基質(zhì)分泌更多。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)瓶 骨軟骨構(gòu)建物 脂肪干細(xì)胞 脫細(xì)胞松質(zhì)骨 水凝膠
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 引言13-15
• 1 文獻(xiàn)綜述15-35
• 1.1 軟骨缺損及其修復(fù)手段15-19
• 1.1.1 軟骨缺損機(jī)制及類型15
• 1.1.2 軟骨缺損的常見(jiàn)修復(fù)方法15-19
• 1.2 軟骨組織工程學(xué)修復(fù)19-28
• 1.2.1 組織工程軟骨19-20
• 1.2.2 種子細(xì)胞20-25
• 1.2.3 支架材料25-28
• 1.3 動(dòng)態(tài)微環(huán)境28-33
• 1.3.1 生物反應(yīng)器及其在組織工程中的應(yīng)用29-31
• 1.3.2 生物反應(yīng)器分類31-33
• 1.4 選題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容33-35
• 2 骨及軟骨支架的制備及其物理性質(zhì)檢測(cè)35-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器35-36
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品35
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器35-36
• 2.2 脫細(xì)胞松質(zhì)骨的制備36-37
• 2.3 松質(zhì)骨支架的物性檢測(cè)37-38
• 2.3.1 骨松質(zhì)形態(tài)觀察及機(jī)械強(qiáng)度37-38
• 2.3.2 掃描電鏡觀察及紅外檢測(cè)38
• 2.4 水凝膠支架的制備38-39
• 2.5 水凝膠支架的物理性能檢測(cè)39
• 2.5.1 支架孔隙率及吸水率的測(cè)定39
• 2.5.2 水凝膠支架的機(jī)械強(qiáng)度及掃描電鏡觀察39
• 2.6 數(shù)據(jù)分析39-40
• 2.7 結(jié)果與討論40-43
• 2.7.1 松質(zhì)骨的外觀及表面結(jié)構(gòu)40
• 2.7.2 骨松質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)組成分析40-41
• 2.7.3 水凝膠的吸水率及孔隙率41-42
• 2.7.4 水凝膠的微觀形貌及機(jī)械強(qiáng)度42-43
• 2.8 小結(jié)43-44
• 3 hADSCs的分離和培養(yǎng)44-52
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料44-46
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)原料與試劑44-45
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備45
• 3.1.3 所需溶液及試劑的配制45-46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法46-48
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)脂肪組織來(lái)源46
• 3.2.2 hADSCs的體外獲得及原代培養(yǎng)46
• 3.2.3 hADSCs的傳代培養(yǎng)46-47
• 3.2.4 hADSCs成軟骨誘導(dǎo)47
• 3.2.5 脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)47-48
• 3.3 結(jié)果與討論48-51
• 3.3.1 不同培養(yǎng)時(shí)間脂肪干細(xì)胞的形態(tài)48-49
• 3.3.2 脂肪干細(xì)胞的軟骨分化能力49-50
• 3.3.3 脂肪干細(xì)胞的骨向分化能力50-51
• 3.4 小結(jié)51-52
• 4 脂肪干細(xì)胞與支架的復(fù)合培養(yǎng)52-76
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備52-53
• 4.1.2 藥品與試劑53
• 4.2 組織工程骨的構(gòu)建53-55
• 4.2.1 動(dòng)靜態(tài)環(huán)境骨部分仿生組織的體外培養(yǎng)53
• 4.2.2 動(dòng)靜態(tài)下支架中細(xì)胞骨向分化檢測(cè)53-54
• 4.2.3 動(dòng)靜態(tài)下支架中細(xì)胞生長(zhǎng)情況54-55
• 4.2.4 動(dòng)靜態(tài)下支架中細(xì)胞代謝分析55
• 4.2.5 掃描電鏡觀察細(xì)胞及胞外基質(zhì)分泌物55
• 4.2.6 數(shù)據(jù)分析55
• 4.3 組織工程軟骨的構(gòu)建55-58
• 4.3.1 動(dòng)靜態(tài)環(huán)境軟骨部分仿生組織的體外培養(yǎng)56
• 4.3.2 動(dòng)靜態(tài)下水凝膠支架中細(xì)胞軟骨分化檢測(cè)56-57
• 4.3.3 動(dòng)靜態(tài)下水凝膠支架中細(xì)胞生長(zhǎng)情況57
• 4.3.4 動(dòng)靜態(tài)下水凝膠支架中細(xì)胞代謝分析57-58
• 4.3.5 SEM及顯微鏡觀察細(xì)胞及胞外基質(zhì)分泌物58
• 4.4 組織工程骨軟骨復(fù)合物構(gòu)建58-59
• 4.4.1 動(dòng)靜態(tài)下骨軟骨仿生組織的體外培養(yǎng)58-59
• 4.4.2 動(dòng)靜態(tài)下雙層支架中細(xì)胞生長(zhǎng)情況59
• 4.4.3 動(dòng)靜態(tài)下雙層支架中細(xì)胞活性及分布觀察59
• 4.4.4 掃描電鏡觀察細(xì)胞及其基質(zhì)分泌59
• 4.5 結(jié)果與討論59-74
• 4.5.1 動(dòng)靜態(tài)環(huán)境下組織工程骨的組織學(xué)檢測(cè)59-65
• 4.5.2 動(dòng)靜態(tài)環(huán)境下組織工程軟骨的組織學(xué)檢測(cè)65-71
• 4.5.3 動(dòng)靜態(tài)環(huán)境下組織工程骨軟骨復(fù)合物的組織學(xué)檢測(cè)71-74
• 4.6 小結(jié)74-76
• 結(jié)論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-87
• 附錄A 英文縮略圖87-88
• 碩士學(xué)位期論文情況88-89
• 致謝89-90

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：354263