本文關(guān)鍵詞：人工細胞外支架：50μm細絲鈦網(wǎng)三維結(jié)構(gòu)對兔骨髓間充質(zhì)干細胞成骨作用的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨質(zhì)缺損仍是目前導致患者功能喪失及生活質(zhì)量降低的重要問題。臨床上最為常用的修復方法仍是自體骨移植，然而這種方法卻存在著一定的弊端。尋求更為合適的骨缺損修復方法成為當今的研究熱點，這就需要多學科的共同努力。組織工程的興起為骨缺損的修復提供了一條廣闊的途徑。上世紀80年代發(fā)現(xiàn)了具有多項分化潛能的間充質(zhì)干細胞，使其成為理想的骨組織工程種子細胞,同時支架材料的研究也逐漸從二維結(jié)構(gòu)向三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。 本實驗提出了具有三維結(jié)構(gòu)特性的鈦網(wǎng)(Titanium web,TW)，擬通過體外成功培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)，觀察鈦網(wǎng)對兔骨髓MSCs的成骨作用。以便了解該材料作為骨組織工程支架材料的特性。 材料和方法 1.本實驗所采用的三維鈦網(wǎng)是由日本Kuboki教授設(shè)計、HI-LEX公司提供的。材料特性為20-100μm直徑的鈦纖維束編織而成，內(nèi)部形狀為類蜂巢狀結(jié)構(gòu)，孔的平均直徑為50-250μm，孔隙率達60-87%（圖1）。選取普通級新西蘭大白兔，4～6周齡。采用20%烏拉坦按以5ml/kg體重的劑量麻醉新西蘭大白兔，無菌條件下取出大白兔的股骨，并移入超凈工作臺。沿股骨干中間剪開，將髓腔內(nèi)容物反復沖出。采用密度梯度離心與全骨髓貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法將兔骨髓間充質(zhì)干細胞從骨髓(Bone marrow,BM)中分離出來。 2.兔骨髓MSCs的鑒定:倒置顯微鏡下觀察細胞的生長特點，選取生長特性穩(wěn)定的第三代細胞，待其達80%融合時，分別換用成骨誘導培養(yǎng)基及成脂肪誘導培養(yǎng)基。2周后通過堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP)染色、茜素紅染色及油紅O染色鑒定細胞是否已發(fā)生定向分化。判斷體外培養(yǎng)的細胞是否為兔骨髓MSCs。 3.將已成功獲得的兔骨髓MSCs與細絲鈦網(wǎng)共同培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞能否順利生長在鈦網(wǎng)上。 4.由于鈦網(wǎng)的不透光性，倒置顯微鏡并不能準確觀察細胞在鈦網(wǎng)上的生長特點，故采用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）來觀察其生長特點。 5.鈦網(wǎng)與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后，取出鈦網(wǎng)，采用ALP染色觀察分析鈦網(wǎng)周圍與其有接觸的兔骨髓MSCs的成骨特性。 結(jié)果 1.原代兔骨髓MSCs培養(yǎng)早期可見少數(shù)單個核細胞貼壁，形態(tài)細胞呈多角形。6-10d后細胞增殖速度加快并且發(fā)生細胞間的融合，細胞形態(tài)表現(xiàn)為成纖維細胞樣的長梭形，且細胞形態(tài)逐漸均一，融合后表現(xiàn)為魚肉狀。 2.對原代培養(yǎng)的兔骨髓MSCs進行成骨及成脂誘導，對于成骨誘導組2周后行茜素紅染色及ALP染色，可見胞漿中有礦化結(jié)節(jié)及較多的棕紅色顆粒。對于成脂誘導組，，顯微鏡下觀察細胞體積變大,核周可見空泡樣結(jié)構(gòu)。進行油紅O染色,可見細胞內(nèi)有紅色脂滴,有的融合成大脂滴,有的成串珠樣排列。 3.將鈦網(wǎng)與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后在倒置顯微鏡下觀察細胞及鈦網(wǎng)的關(guān)系時，由于鈦網(wǎng)的不透光性，偶可見鈦網(wǎng)支架邊上有細胞生長。通過SEM，可以觀察到兔骨髓MSCs能良好的生長在鈦網(wǎng)上，細胞與材料復合培養(yǎng)1周后，細胞已在材料表面和孔隙內(nèi)均可黏附和生長，但數(shù)量較少；隨著時間的延長，細胞進一步生長、分化和增殖。2周后大量細胞粘附在鈦網(wǎng)上，細胞數(shù)量明顯多于1周時，細胞形態(tài)呈長梭形，細胞間相互交錯生長，呈網(wǎng)狀覆蓋材料的表面，同時可見細胞分泌的基質(zhì)也沉積于細胞周圍及支架表面。 4.鈦網(wǎng)與兔骨髓間充質(zhì)干細胞共同培養(yǎng)2周后，取出鈦網(wǎng)，將位于孔板底部的細胞進行ALP染色，見與鈦網(wǎng)接觸想細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多的棕紅色顆粒，并且顆粒聚集呈線形。而對照組呈弱陽性，僅有少量棕紅色顆粒，且顆粒呈散在分布。 結(jié)論 1.通過密度梯度離心與全骨髓貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法能成功體外分離及培養(yǎng)兔骨髓MSCs。 2.具有三維結(jié)構(gòu)的人工細胞外支架50μm細絲鈦網(wǎng)對兔骨髓MSCs無毒性，細胞能良好的生長在支架上，且鈦網(wǎng)支架能促進兔骨髓MSCs向成骨細胞方向分化，為其成為理想骨組織工程修復材料提供一定的實驗基礎(chǔ)及支持。
【關(guān)鍵詞】：細胞外支架 50μm細絲鈦網(wǎng) 三維結(jié)構(gòu) 骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 符號說明5-6
• 摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 前言15-16
• 第一部分 兔骨髓間充質(zhì)干細胞的體外分離、培養(yǎng)及誘導分化16-24
• 1 材料與方法16-21
• 2 結(jié)果21-22
• 3 討論22-24
• 第二部分 人工細胞外支架：50μm 細絲鈦網(wǎng)三維結(jié)構(gòu)對兔骨髓 BMCs 成骨的實驗研究24-29
• 1 材料與方法24-27
• 2 結(jié)果27
• 3 討論27-29
• 全文總結(jié)29-30
• 參考文獻30-35
• 附圖35-38
• 文獻綜述38-46
• 參考文獻42-46
• 致謝46-47
• 研究生期間發(fā)表的論文47-48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 宮曉潔;孫莉;黎靖宇;陳維平;;小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察[J];解剖學研究;2008年01期

2 黃宗文;黃創(chuàng)新;;組織工程化同種異體骨移植修復骨缺損[J];中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2008年04期

3 馬武秀;程迅生;;自體骨移植修復骨缺損的研究進展[J];中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2011年06期

4 張貝利,張偉濱,鄧廉夫;同種異體骨移植研究進展[J];國外醫(yī)學(骨科學分冊);2005年03期

5 徐麟皓;王麗娜;朱一苗;張曉明;;同種異體骨制備保存研究進展[J];國際骨科學雜志;2008年05期

6 朱良,艾合麥提江·玉素甫;異體骨移植材料的研究現(xiàn)狀及進展[J];生物骨科材料與臨床研究;2005年03期

7 閔理;;異種骨移植修復大段骨缺損的研究進展[J];中國骨與關(guān)節(jié)外科;2011年02期

8 邸軍;張奉琪;馮文嶺;于金合;;髂骨移植并發(fā)癥的相關(guān)研究[J];中國矯形外科雜志;2006年10期

  本文關(guān)鍵詞：人工細胞外支架：50μm細絲鈦網(wǎng)三維結(jié)構(gòu)對兔骨髓間充質(zhì)干細胞成骨作用的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：353834