本文關(guān)鍵詞：人工細(xì)胞外支架：50μm細(xì)絲鈦網(wǎng)三維結(jié)構(gòu)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨作用的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨質(zhì)缺損仍是目前導(dǎo)致患者功能喪失及生活質(zhì)量降低的重要問(wèn)題。臨床上最為常用的修復(fù)方法仍是自體骨移植，然而這種方法卻存在著一定的弊端。尋求更為合適的骨缺損修復(fù)方法成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，這就需要多學(xué)科的共同努力。組織工程的興起為骨缺損的修復(fù)提供了一條廣闊的途徑。上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)了具有多項(xiàng)分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，使其成為理想的骨組織工程種子細(xì)胞,同時(shí)支架材料的研究也逐漸從二維結(jié)構(gòu)向三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。 本實(shí)驗(yàn)提出了具有三維結(jié)構(gòu)特性的鈦網(wǎng)(Titanium web,TW)，擬通過(guò)體外成功培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)，觀察鈦網(wǎng)對(duì)兔骨髓MSCs的成骨作用。以便了解該材料作為骨組織工程支架材料的特性。 材料和方法 1.本實(shí)驗(yàn)所采用的三維鈦網(wǎng)是由日本Kuboki教授設(shè)計(jì)、HI-LEX公司提供的。材料特性為20-100μm直徑的鈦纖維束編織而成，內(nèi)部形狀為類蜂巢狀結(jié)構(gòu)，孔的平均直徑為50-250μm，孔隙率達(dá)60-87%（圖1）。選取普通級(jí)新西蘭大白兔，4～6周齡。采用20%烏拉坦按以5ml/kg體重的劑量麻醉新西蘭大白兔，無(wú)菌條件下取出大白兔的股骨，并移入超凈工作臺(tái)。沿股骨干中間剪開(kāi)，將髓腔內(nèi)容物反復(fù)沖出。采用密度梯度離心與全骨髓貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓(Bone marrow,BM)中分離出來(lái)。 2.兔骨髓MSCs的鑒定:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，選取生長(zhǎng)特性穩(wěn)定的第三代細(xì)胞，待其達(dá)80%融合時(shí)，分別換用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基。2周后通過(guò)堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP)染色、茜素紅染色及油紅O染色鑒定細(xì)胞是否已發(fā)生定向分化。判斷體外培養(yǎng)的細(xì)胞是否為兔骨髓MSCs。 3.將已成功獲得的兔骨髓MSCs與細(xì)絲鈦網(wǎng)共同培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞能否順利生長(zhǎng)在鈦網(wǎng)上。 4.由于鈦網(wǎng)的不透光性，倒置顯微鏡并不能準(zhǔn)確觀察細(xì)胞在鈦網(wǎng)上的生長(zhǎng)特點(diǎn)，故采用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）來(lái)觀察其生長(zhǎng)特點(diǎn)。 5.鈦網(wǎng)與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后，取出鈦網(wǎng)，采用ALP染色觀察分析鈦網(wǎng)周圍與其有接觸的兔骨髓MSCs的成骨特性。 結(jié)果 1.原代兔骨髓MSCs培養(yǎng)早期可見(jiàn)少數(shù)單個(gè)核細(xì)胞貼壁，形態(tài)細(xì)胞呈多角形。6-10d后細(xì)胞增殖速度加快并且發(fā)生細(xì)胞間的融合，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，且細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，融合后表現(xiàn)為魚(yú)肉狀。 2.對(duì)原代培養(yǎng)的兔骨髓MSCs進(jìn)行成骨及成脂誘導(dǎo)，對(duì)于成骨誘導(dǎo)組2周后行茜素紅染色及ALP染色，可見(jiàn)胞漿中有礦化結(jié)節(jié)及較多的棕紅色顆粒。對(duì)于成脂誘導(dǎo)組，，顯微鏡下觀察細(xì)胞體積變大,核周可見(jiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)。進(jìn)行油紅O染色,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴,有的融合成大脂滴,有的成串珠樣排列。 3.將鈦網(wǎng)與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞及鈦網(wǎng)的關(guān)系時(shí)，由于鈦網(wǎng)的不透光性，偶可見(jiàn)鈦網(wǎng)支架邊上有細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)SEM，可以觀察到兔骨髓MSCs能良好的生長(zhǎng)在鈦網(wǎng)上，細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)1周后，細(xì)胞已在材料表面和孔隙內(nèi)均可黏附和生長(zhǎng)，但數(shù)量較少；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)、分化和增殖。2周后大量細(xì)胞粘附在鈦網(wǎng)上，細(xì)胞數(shù)量明顯多于1周時(shí)，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間相互交錯(cuò)生長(zhǎng)，呈網(wǎng)狀覆蓋材料的表面，同時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞分泌的基質(zhì)也沉積于細(xì)胞周圍及支架表面。 4.鈦網(wǎng)與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)2周后，取出鈦網(wǎng)，將位于孔板底部的細(xì)胞進(jìn)行ALP染色，見(jiàn)與鈦網(wǎng)接觸想細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多的棕紅色顆粒，并且顆粒聚集呈線形。而對(duì)照組呈弱陽(yáng)性，僅有少量棕紅色顆粒，且顆粒呈散在分布。 結(jié)論 1.通過(guò)密度梯度離心與全骨髓貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法能成功體外分離及培養(yǎng)兔骨髓MSCs。 2.具有三維結(jié)構(gòu)的人工細(xì)胞外支架50μm細(xì)絲鈦網(wǎng)對(duì)兔骨髓MSCs無(wú)毒性，細(xì)胞能良好的生長(zhǎng)在支架上，且鈦網(wǎng)支架能促進(jìn)兔骨髓MSCs向成骨細(xì)胞方向分化，為其成為理想骨組織工程修復(fù)材料提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及支持。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞外支架 50μm細(xì)絲鈦網(wǎng) 三維結(jié)構(gòu) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明5-6
• 摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 前言15-16
• 第一部分 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化16-24
• 1 材料與方法16-21
• 2 結(jié)果21-22
• 3 討論22-24
• 第二部分 人工細(xì)胞外支架：50μm 細(xì)絲鈦網(wǎng)三維結(jié)構(gòu)對(duì)兔骨髓 BMCs 成骨的實(shí)驗(yàn)研究24-29
• 1 材料與方法24-27
• 2 結(jié)果27
• 3 討論27-29
• 全文總結(jié)29-30
• 參考文獻(xiàn)30-35
• 附圖35-38
• 文獻(xiàn)綜述38-46
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 致謝46-47
• 研究生期間發(fā)表的論文47-48

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人工細(xì)胞外支架：50μm細(xì)絲鈦網(wǎng)三維結(jié)構(gòu)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨作用的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：353834