滑膜間充質干細胞/軟骨細胞與ECM-PCL-HA構建關節(jié)軟骨體外研究
發(fā)布時間：2021-11-20 10:14
目的:本研究觀察三維條件下富含滑膜間充質干細胞/軟骨細胞的脫去細胞含有細胞外基質的支架復合物成軟骨能力。方法:（1）兔膝關節(jié)滑膜組織及軟骨組織、腹股溝部脂肪組織分離培養(yǎng),體外擴增。（2）取生長良好的第1代脂肪間充質干細胞用慢病毒介導TGF-β3轉染,后接種于3D打印的聚己內酯/羥基磷灰石（PCL-HA）復合支架材料。（3）將滑膜間充質干細胞/軟骨細胞接種于構建好的富細胞外基質（ECM）的支架材料體外培養(yǎng)構建關節(jié)軟骨。（4）采用RT-PCR檢測RNA水平上COL-I、COL-II、SOX-9、Aggrecan基因表達的影響。（5）采用免疫印跡法檢測軟骨特異性蛋白的表達。結果:（1）將接種轉染后的脂肪間充質干細胞的支架復合物培養(yǎng)14d后,激光共聚焦掃描可見細胞在支架表面分布均勻,逐層掃描后細胞逐漸減少。（2）將滑膜間充質干細胞/軟骨細胞混合培養(yǎng)于ECM-PCL-HA支架材料后,體外培養(yǎng)1周、2周及4周后,經(jīng)實時熒光定量PCR,滑膜間充質干細胞/軟骨細胞接種于ECM-PCL-HA組,單純滑膜間充質干細胞或單純軟骨細胞接種于ECM-PCL-HA組,從時間上（1周,2周及4周）可見Aggreca...
【文章來源】：新疆醫(yī)科大學新疆維吾爾自治區(qū)
【文章頁數(shù)】：46 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
兔來源脂肪間充質干細胞（a.原代ADSCsb.第三代細胞ADSCs）
新疆醫(yī)科大學碩士學位論文17圖2兔來源滑膜間充質干細胞（a.原代SMSCsb.第二代細胞SMSCs）Fig.2MorphologyofRabbitsynovialmesenchymalstemcells(a.P0b.P2)圖3兔來源軟骨細胞（a.原代軟骨細胞b.第二代軟骨細胞）Fig.3MorphologyofRabbitchondrocytes(a.P0b.P2)1.2PCL-HA支架材料對滑膜間充質干細胞的細胞毒性檢測使用CCK-8法檢測PCL-HA支架材料浸泡提取液對滑膜間充質干細胞毒性的檢測結果（如表5所示），繪制成折線圖后可見，P3代中滑膜間充質干細胞從第一天至第四天呈對數(shù)生長狀態(tài)，第四天達到高峰期，第六天生長逐漸進入平臺期且細胞等增殖狀態(tài)逐漸減慢，整體的SMSCs細胞PCL-HA支架材料的毒性檢測可見呈“S”形（圖4）。計算統(tǒng)計值兩組之間結果表明P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，提示兩組細胞生長無明顯差異，說明PCL-HA支架材料對SMSCs細胞無明顯毒性作用，對細胞的增殖無影響。
新疆醫(yī)科大學碩士學位論文18表5細胞毒性所測A值(x±s）Table5ProliferationcurvesofmeasuredvalueofA分組天數(shù)（d）1d2d3d4d5d6d7d8d9dA組0.619±0.0941.089±0.1011.852±0.1182.594±0.1672.462±0.1322.723±0.4032.801±0.2022.651±0.3271.235±0.084B組0.623±0.1141.035±0.0551.923±0.0542.585±0.2242.371±0.2252.708±0.1202.802±0.1772.705±.0.1691.184±0.141圖4PCL-HA支架對滑膜間充質干細胞毒性的增殖曲線檢測（注：1×103個細胞）Fig.4DetectionofPCL-HAscaffoldsontheproliferationofsynovialmesenchymalstemcells圖注：A組為正常DMEM培養(yǎng)基，B組為PCL-HA支架材料浸泡后的DMEM。2ECM-PCL-HA支架材料的制備2.1將ADSCs用攜帶TGF-β3的慢病毒轉染正常脂肪間充質干細胞于熒光倒置顯微鏡或共聚焦顯微鏡下無熒光顯影效果，將其轉染攜帶TGF-β3的慢病毒72h后于熒光倒置顯微鏡下觀察，細胞核及細胞質內均可見綠色熒光顯影效果（圖5a）。提示攜帶TGF-β3的慢病毒已轉染至脂肪間充質干細胞內，因其轉染至細胞核內，提示將其傳代后也可穩(wěn)定表達（圖5b）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]三維環(huán)境下軟骨細胞誘導滑膜間充質干細胞向軟骨樣細胞的分化[J]. 楊萌,邵博,龔忠誠,寧曉婷,劉慧,克熱木·阿巴斯,凌彬,尹小朋,王冰,胡露露,王玥,胡鑫,林兆全. 中國組織工程研究. 2016(11)
[2]Current research on pharmacologic and regenerative therapies for osteoarthritis[J]. Wei Zhang,Hongwei Ouyang,Crispin R Dass,Jiake Xu. Bone Research. 2015(04)
[3]慢病毒介導重組質粒轉染兔下頜骨骨髓間充質干細胞[J]. 劉曉昌,趙英華,楊子檜,王磊. 中國組織工程研究. 2014(37)
[4]TGF-β3真核表達載體轉染骨髓基質干細胞促進其向軟骨分化的實驗研究[J]. 鄭東,楊述華,袁曉梅,李進,馮勇,徐亮,梅榮成. 中國矯形外科雜志. 2007(06)
本文編號：3507110
【文章來源】：新疆醫(yī)科大學新疆維吾爾自治區(qū)
【文章頁數(shù)】：46 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
兔來源脂肪間充質干細胞（a.原代ADSCsb.第三代細胞ADSCs）
新疆醫(yī)科大學碩士學位論文17圖2兔來源滑膜間充質干細胞（a.原代SMSCsb.第二代細胞SMSCs）Fig.2MorphologyofRabbitsynovialmesenchymalstemcells(a.P0b.P2)圖3兔來源軟骨細胞（a.原代軟骨細胞b.第二代軟骨細胞）Fig.3MorphologyofRabbitchondrocytes(a.P0b.P2)1.2PCL-HA支架材料對滑膜間充質干細胞的細胞毒性檢測使用CCK-8法檢測PCL-HA支架材料浸泡提取液對滑膜間充質干細胞毒性的檢測結果（如表5所示），繪制成折線圖后可見，P3代中滑膜間充質干細胞從第一天至第四天呈對數(shù)生長狀態(tài)，第四天達到高峰期，第六天生長逐漸進入平臺期且細胞等增殖狀態(tài)逐漸減慢，整體的SMSCs細胞PCL-HA支架材料的毒性檢測可見呈“S”形（圖4）。計算統(tǒng)計值兩組之間結果表明P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，提示兩組細胞生長無明顯差異，說明PCL-HA支架材料對SMSCs細胞無明顯毒性作用，對細胞的增殖無影響。
新疆醫(yī)科大學碩士學位論文18表5細胞毒性所測A值(x±s）Table5ProliferationcurvesofmeasuredvalueofA分組天數(shù)（d）1d2d3d4d5d6d7d8d9dA組0.619±0.0941.089±0.1011.852±0.1182.594±0.1672.462±0.1322.723±0.4032.801±0.2022.651±0.3271.235±0.084B組0.623±0.1141.035±0.0551.923±0.0542.585±0.2242.371±0.2252.708±0.1202.802±0.1772.705±.0.1691.184±0.141圖4PCL-HA支架對滑膜間充質干細胞毒性的增殖曲線檢測（注：1×103個細胞）Fig.4DetectionofPCL-HAscaffoldsontheproliferationofsynovialmesenchymalstemcells圖注：A組為正常DMEM培養(yǎng)基，B組為PCL-HA支架材料浸泡后的DMEM。2ECM-PCL-HA支架材料的制備2.1將ADSCs用攜帶TGF-β3的慢病毒轉染正常脂肪間充質干細胞于熒光倒置顯微鏡或共聚焦顯微鏡下無熒光顯影效果，將其轉染攜帶TGF-β3的慢病毒72h后于熒光倒置顯微鏡下觀察，細胞核及細胞質內均可見綠色熒光顯影效果（圖5a）。提示攜帶TGF-β3的慢病毒已轉染至脂肪間充質干細胞內，因其轉染至細胞核內，提示將其傳代后也可穩(wěn)定表達（圖5b）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]三維環(huán)境下軟骨細胞誘導滑膜間充質干細胞向軟骨樣細胞的分化[J]. 楊萌,邵博,龔忠誠,寧曉婷,劉慧,克熱木·阿巴斯,凌彬,尹小朋,王冰,胡露露,王玥,胡鑫,林兆全. 中國組織工程研究. 2016(11)
[2]Current research on pharmacologic and regenerative therapies for osteoarthritis[J]. Wei Zhang,Hongwei Ouyang,Crispin R Dass,Jiake Xu. Bone Research. 2015(04)
[3]慢病毒介導重組質粒轉染兔下頜骨骨髓間充質干細胞[J]. 劉曉昌,趙英華,楊子檜,王磊. 中國組織工程研究. 2014(37)
[4]TGF-β3真核表達載體轉染骨髓基質干細胞促進其向軟骨分化的實驗研究[J]. 鄭東,楊述華,袁曉梅,李進,馮勇,徐亮,梅榮成. 中國矯形外科雜志. 2007(06)
本文編號：3507110
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