發(fā)布時(shí)間：2017-05-06 19:09

  本文關(guān)鍵詞：絲素蛋白—?dú)ぞ厶蔷忈屛⑶虻闹苽渑c表征，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：微球和微囊被廣泛運(yùn)用于生物材料和藥劑學(xué)中,微球和微囊可以作為藥物或者細(xì)胞生長因子的包裹材料,使藥物或生長因子能夠長時(shí)有效地緩慢釋放,從而延長藥物的作用時(shí)間,使藥物能夠靶向作用于細(xì)胞和組織。近些年來,緩釋微球或者微囊的研究很多,許多研究者做了大量的工作,目前的研究重點(diǎn)在于選用毒副作用更小的生物材料,如何減少初期爆釋和延長緩釋周期等。 絲素蛋白是由蠶絲脫膠而得到的天然高分子纖維蛋白,含量約占蠶絲的70%-80%,富含丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸等18種氨基酸,具有良好的生物相容性、生物降解性、能夠支持細(xì)胞的黏附、遷移和增殖。絲素蛋白有Silk Ⅰ和SilkⅡ兩種構(gòu)象,Silk Ⅰ=包括無序卷曲狀和α螺旋狀,Silk Ⅱ是反平行的β折疊狀,p結(jié)構(gòu)的增加使絲素蛋白構(gòu)成的復(fù)合物更加穩(wěn)定。絲素蛋白因其獨(dú)特的加工成型性、生物相容性和生物降解性,廣泛被用于組織工程中的支架材料和控釋系統(tǒng)的載體中。但是以單一的絲素蛋白作為微球或微囊材料,沒有克服初期爆釋包載物,絲素蛋白較脆以及機(jī)械性能不佳等缺點(diǎn)。 殼聚糖是由甲殼素脫乙酰得來,是天然中存在的唯一的堿性親水多糖,殼聚糖的來源廣泛,無毒性無不良反應(yīng),有良好的生物相容性、可降解性、良好的可塑性和抑菌性,抗凝血及促進(jìn)傷口愈合的能力,被廣泛的用于藥劑學(xué)或者生物材料中作為緩釋材料。單純的殼聚糖作為載體時(shí),其藥物的裝載率較低,為了克服這一缺點(diǎn),有研究就將其它材料與殼聚糖復(fù)合,進(jìn)行改性,對(duì)比單殼聚糖微球,復(fù)合微球的載藥率更高以及其釋放效率更佳。因此,我們猜想以絲素蛋白和殼聚糖復(fù)合相互改性,使得絲素蛋白和殼聚糖的理化性能更佳,能夠減少包載物的初期爆釋,微球的釋放效率更佳。 京尼平是一種天然交聯(lián)劑,是從梔子中提取出來的,一種白色晶體,溶于水的具有雙官能團(tuán)的交聯(lián)劑。當(dāng)它與具有氨基的聚合物反應(yīng)時(shí),會(huì)從白色變成深藍(lán)色,京尼平這種天然的交聯(lián)劑比常用的交聯(lián)劑,如戊二醛,毒性要小了近10000倍[12],H.C.Liang[13]等將殼聚糖微球注入到大鼠模型中發(fā)現(xiàn)以京尼平交聯(lián)的微球比戊二醛交聯(lián)的微球有更好的組織愈合性和更為緩慢的降解性,在藥物緩釋方面,以戊二醛交聯(lián)白蛋白,多糖或者明膠制備的微球其生物相容性比京尼平交聯(lián)制備的這些微球要差較多。并且有報(bào)道認(rèn)為京尼平作為交聯(lián)劑能有效地改進(jìn)材料的機(jī)械性能,如以京尼平交聯(lián)制備的絲素蛋白/殼聚糖海綿,其穩(wěn)定性有了明顯的提升而且具有較好的生物相容性。 以京尼平交聯(lián)制備的絲素蛋白/殼聚糖緩釋微球并沒有報(bào)道過。本課題以絲素蛋白,殼聚糖和京尼平作為合成微球的生物材料,研制新穎的緩釋微球,并以牛血清白蛋白作為模型藥物包載,對(duì)其表觀,理化性能和緩釋效能進(jìn)行評(píng)價(jià),為包載其它藥物模型,細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 第一部分以京尼平交聯(lián)的絲素蛋白-殼聚糖微球的制備與表征 目的 制備絲素蛋白-殼聚糖微球,考察微球的表觀形態(tài)、粒徑、溶脹率和表征微球特性,探索制備微球時(shí),絲素蛋白與殼聚糖最佳的比例及交聯(lián)劑京尼平最佳的量。 方法 1.以乳化交聯(lián)法,京尼平為交聯(lián)劑,按絲素蛋白和殼聚糖不同的比例(比例為殼聚糖：絲素蛋白=1：1,1：0.5,1：2)以及不同的京尼平質(zhì)量(0.01g,0.05g,0.1g,0.5g,1g)進(jìn)行交叉組合,制備絲素蛋白-殼聚糖微球； 2.通過掃描電鏡篩觀察制備得出的微球形態(tài),選出形態(tài)最佳的微球； 3.以激光粒徑分析儀分析微球的粒徑； 4.取干燥的質(zhì)量Wd=0.1g的絲素蛋白-殼聚糖微球懸浮于裝有5m1的去離子水離心管中,在搖床上以100r/min中溫和地震動(dòng),然后每隔一段時(shí)間(0.5h,1h,2h,4h,6h,8h,10h)離心后,用濾紙擦拭溶脹微球表面的水分,立即稱重質(zhì)量為Ws,溶脹率公式如下：Esw(%)=[(Ws-Wd)/Wd]*100%平衡水含量公式如下：EWC(%):[(Wc-Wd)/Wc]*100%Wc為溶脹的微球在平衡水含量時(shí)的質(zhì)量,試驗(yàn)重復(fù)三次。 5.X-射線衍射及傅里葉紅外光譜對(duì)微球的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征分析。 結(jié)果 1.以京尼平1g,CS:SF=1:1；京尼平0.05g,CS:SF=1:1；京尼平0.5g,CS:SF=1:2；京尼平0.5g,CS:SF=1:0.5；京尼平0.1g,CS:SF=1:0.5,這五種比例制備出的微球,形態(tài)較為規(guī)則,表面較光滑,粒徑分布均勻,其中以京尼平0.05g,CS:SF=1:1制備出微球,其表面形態(tài)最為平滑,規(guī)則,各個(gè)微球最為均一,單從形態(tài)學(xué)來看,推測可能以此種比例制備的微球最佳。 2.激光粒徑分析儀示五組微球粒徑分別為(71.13±0.85μm),(146.60±3.46μm),(74.09±1.07μm),(89.00±1.08μm)和(109.83±2.28μm)。 3.所有制備出來的微球,在浸入去離子水6小時(shí)以后,其溶脹率都達(dá)到了平衡。五組微球的平衡水含量分別為60.10±0.48%,63.34±1.29%,58.33±0.35%,58.67±1.45%和59.60±2.19%,其中京尼平0.05g,CS:SF=1:1制備出的微球平衡水含量與其余四組微球平衡水含量有顯著性差異(P0.05)。 4.傅里葉紅外光譜分析證實(shí),京尼平將絲素蛋白和殼聚糖的酰胺基Ⅱ(NH2)交聯(lián),證明了絲素蛋白和殼聚糖并不是簡單的混合,而是以交聯(lián)氨基的形式復(fù)合。此外,絲素蛋白與殼聚糖相互改性,絲素蛋白的結(jié)構(gòu)從α螺旋狀或者無序卷曲狀改變?yōu)棣抡郫B狀。 5.X-射線衍射分析證實(shí)結(jié)果與FTIR的檢測結(jié)果一致,說明,絲素蛋白和殼聚糖不是簡單的物理混合,它們通過京尼平的交聯(lián),發(fā)生一定上的結(jié)構(gòu)變化,絲素蛋白從無序卷曲狀或者α螺旋狀轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的β折疊狀,其結(jié)晶度和規(guī) 整度得到了一定程度上的提高；絲素蛋白和殼聚糖之間發(fā)生了一些化學(xué)鍵的 結(jié)合。 結(jié)論 以合適的比例混合絲素蛋白和殼聚糖,并加入一定劑量的京尼平,通過無機(jī)乳化交聯(lián)法能夠制備出物理化學(xué)性質(zhì)較佳的絲素蛋白-殼聚糖微球。 第二部分以京尼平交聯(lián)包載牛血清白蛋白的絲素蛋白-殼聚糖微球的制備與表征 目的 以京尼平交聯(lián)制備絲素蛋白-殼聚糖微球,BSA作為模型蛋白,評(píng)價(jià)絲素蛋白/殼聚糖微球的物理化學(xué)性質(zhì)及緩釋能力。方法 1.以乳化交聯(lián)法,京尼平為交聯(lián)劑,加入不同質(zhì)量的BSA(10mg,20mg,50mg),制備緩釋BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球； 2.通過掃描電鏡觀察微球表面形態(tài)并在有標(biāo)尺的掃描電鏡視野下,隨機(jī)選擇有代表性的區(qū)域,計(jì)算200個(gè)微球粒徑,以統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出微球粒徑； 3.X-射線衍射,傅里葉紅外光譜以及熱重分析對(duì)微球表征分析; 4.以BCA法測定三組微球的包封率,載藥率：取適量制備微球時(shí)的離心液及洗滌液,用BCA微量蛋白測定法測定離心液及洗滌液中的BSA含量,按照如下公式計(jì)算微球的包封率和載藥率。包封率=(投入BSA的量-離心液及洗滌液中BSA的量)/投入BSA的量*100%；載藥率=(投入BSA的量-離心液及洗滌液中BSA的量)/微球質(zhì)量*100% 5.以BCA法測定三組微球21天的累積緩釋率：稱取含BSA1.5mg的微球粉末,懸于15m1離心管中,加入10mlPH值為7.4的PBS緩沖液,將離心管置于搖床中,搖床以水平式100r·min-1搖動(dòng),在第1,2,4,8,14和21天,取上清液20μl,以BCA微量蛋白測定法測定上清液中的BSA含量。累積釋放率=上清液中BSA的釋放量/微球中的含藥量*100% 結(jié)果 1.以京尼平交聯(lián)制備的絲素蛋白-殼聚糖微球,表面較光滑,為規(guī)則的球形大小均勻,微球稍有粘連,其中投入10mg的牛血清白蛋白合成的微球形態(tài)最為規(guī)則光滑。三組微球的粒徑分別為7.84±0.97μm,7.53±1.15μm和6.52±0.92μm 2.傅里葉紅外光譜分析證實(shí),京尼平將絲素蛋白和殼聚糖的酰胺基Ⅱ(NH2)交聯(lián),證明了絲素蛋白和殼聚糖并不是簡單的混合,而是以交聯(lián)氨基的形式復(fù)合,說明絲素蛋白與殼聚糖相互改性,絲素蛋白的結(jié)構(gòu)從α螺旋狀或者無序卷曲狀改變?yōu)棣抡郫B狀。BSA與殼聚糖,絲素蛋白和京尼平間沒有發(fā)生反應(yīng),BSA被包載進(jìn)微球中。 3.X-射線衍射分析證實(shí),絲素蛋白和殼聚糖不是簡單的物理混合,它們通過京尼平的交聯(lián),發(fā)生一定上的結(jié)構(gòu)變化,絲素蛋白從無序卷曲狀或者α螺旋狀轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的β折疊狀,其結(jié)晶度和規(guī)整度得到了一定程度上的提高；10mg組的BSA的特征峰消失,說明了BSA是以非晶狀形態(tài)包載于微球中的,而50mg和20mg組有部分BSA特征峰未消失,可能是因?yàn)橥端幜枯^大,BSA沒有完全包載進(jìn)微球中并有大部分的BSA粘附于微球表面。 4.熱重分析證實(shí),BSA被包載進(jìn)絲素蛋白/殼聚糖微球中,BSA與殼聚糖,絲素蛋白和京尼平間沒有發(fā)生反應(yīng)。 5.BCA微量蛋白測定,10mg,20mg和50mg微球組的包封率分別為50.16±4.32%,56.58±3.58%和42.19±7.47%,載藥率分別為1.25±0.11%,2.83±0.18%和5.27±0.93%。21天的累積釋放率分別為79.16±4.31%,75.2±2.53%和89.04%±4.68%。 結(jié)論 以京尼平交聯(lián)制備的絲素蛋白-殼聚糖微球,隨著BSA的投入量增加,包封率下降,當(dāng)投入BSA的量過大時(shí),會(huì)有較多的BSA粘附于微球表面。微球的緩釋能力顯著,緩釋復(fù)合Higuchi方程。 第三部分包載BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球與純殼聚糖微球的緩釋效能對(duì)比研究 目的 對(duì)比包載BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球和純殼聚糖微球的緩釋效能。 方法 1.以乳化交聯(lián)法制備空白絲素蛋白-殼聚糖微球,包載10mg BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球和純殼聚糖微球； 2.通過掃描電鏡觀察微球表面形態(tài)； 3.以BCA法測定該兩組載藥微球的包封率,載藥率和21天的累積緩釋率。 結(jié)果 1.包載BSA絲素蛋白-殼聚糖和單純殼聚糖微球比空白微球更加光滑完整,為規(guī)則的球形大小均勻,而空白微球稍有凹陷。 2.以BCA法測得包載BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球的包封率為50.16±4.32%,載藥率為1.25±0.11%；純殼聚糖微球的包封率為52.77±1.26%,載藥率為2.64±0.06%。 3.包載BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球,在第一天爆釋了總量的30.79±3.43%,而純殼聚糖微球釋放了39.53±1.76%。在第二十一天,絲素蛋白/殼聚糖微球總共釋放了總量的75.20±2.52%,純殼聚糖微球釋放了83.57±2.33%。 結(jié)論 絲素蛋白-殼聚糖微球比單純的殼聚糖微球的包封率和載藥率要低一些,但是微球初期包載物的爆釋量比單純殼聚糖微球要低,絲素蛋白/殼聚糖微球的緩釋性能比單純的殼聚糖微球要更加平穩(wěn)。
【關(guān)鍵詞】：絲素蛋白 殼聚糖 京尼平 牛血清白蛋白 微球 緩釋
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R783.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 第一章 緒論20-28
• 1.1 微球和微囊的材料分類21-24
• 1.1.1 可降解的人工合成高分子材料22-23
• 1.1.2 可降解的天然高分子材料23-24
• 1.2 理想的微球微囊材料的要求24
• 1.3 微球材料的選擇24-26
• 1.3.1 絲素蛋白24-25
• 1.3.2 殼聚糖25
• 1.3.3 京尼平25-26
• 1.3.4 牛血清白蛋白26
• 1.4 本論文的研究內(nèi)容26-28
• 第二章 以京尼平交聯(lián)的絲素蛋白-殼聚糖微球的制備與表征28-43
• 2.1 材料及方法28-31
• 2.2 絲素蛋白-殼聚糖微球的表征30-31
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析31
• 2.4 結(jié)果31-41
• 2.5 討論41-42
• 2.6 結(jié)論42-43
• 第三章 以京尼平交聯(lián)包載BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球的制備與表征43-57
• 3.1 材料及方法43-45
• 3.1.1 材料43
• 3.1.2 方法43-45
• 3.2 絲素蛋白-殼聚糖緩釋微球的表征45-46
• 3.2.1 微球表面形態(tài)研究和粒徑分析45
• 3.2.2 微球溶脹率,包封率和載藥率45-46
• 3.2.3 微球的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)研究46
• 3.2.4 微球的X-射線衍射學(xué)(XRD)研究46
• 3.2.5 微球的熱重分析46
• 3.2.6 微球的體外釋放實(shí)驗(yàn)46
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析46-47
• 3.4 結(jié)果47-55
• 3.4.1 微球的表面形態(tài)和粒徑分析結(jié)果(圖8)47
• 3.4.2 微球的包封率,載藥率和溶脹率47-50
• 3.4.3 FTIR分析結(jié)果50-51
• 3.4.4 XRD分析結(jié)果51-52
• 3.4.5 熱重分析結(jié)果52-53
• 3.4.6 包載BSA微球的體外釋放的結(jié)果53-55
• 3.5 討論55-56
• 3.6 結(jié)論56-57
• 第四章 包載BSA的絲素蛋白-殼聚糖微球與純殼聚糖微球的緩釋效能對(duì)比研究57-65
• 4.1 材料及方法57-58
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑57
• 4.1.2 方法57-58
• 4.2 三組微球的表征58-59
• 4.2.1 微球表面形態(tài)研究58
• 4.2.2 微球溶脹率,包封率和載藥率58-59
• 4.2.3 微球的體外釋放實(shí)驗(yàn)59
• 4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析59
• 4.4 結(jié)果59-63
• 4.4.1 微球的表面形態(tài)(圖14)59-60
• 4.4.2 微球的包封率,載藥率和溶脹率60-62
• 4.4.3 包載BSA微球的體外釋放結(jié)果62-63
• 4.5 討論63-65
• 第五章 全文總結(jié)65-66
• 第六章 不足與展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 綜述74-87
• 參考文獻(xiàn)83-87
• 在讀期間研究成果87-88
• 致謝88-89

【參考文獻(xiàn)】

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