二次諧波成像是近年來(lái)發(fā)展的一種新的光學(xué)成像技術(shù),作為生物結(jié)構(gòu)檢測(cè)和耐久追蹤標(biāo)記的新工具已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注。二次諧波成像技術(shù)避免了經(jīng)典熒光探針會(huì)遇到的許多固有缺點(diǎn),是一種理想的活體成像方法,具有很好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。本文系統(tǒng)介紹了二次諧波原理及其成像裝置,二次諧波介質(zhì)分類及特點(diǎn),二次諧波在生物醫(yī)學(xué)成像中的應(yīng)用,最后對(duì)二次諧波成像未來(lái)的機(jī)遇和將要面對(duì)的挑戰(zhàn)進(jìn)行了展望。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)激光. 2020,47(02)北大核心EICSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：13 頁(yè)

【部分圖文】：

單光子熒光、雙光子熒光和二次諧波的原理示意圖。(a)單光子熒光和雙光子熒光;(b)二次諧波產(chǎn)生[4]

二次諧波成像的基本裝置要求配備有飛秒激光器作為激發(fā)光源的掃描共聚焦顯微鏡。目前有許多商用的多光子共聚焦顯微鏡可以用于SHG成像,也有自主組裝的SHG成像實(shí)驗(yàn)裝置,這些裝置一般都會(huì)使用如圖2類似的系統(tǒng)[13]。最常使用的激光器是Nd\:YVO4(532 nm; 5～18 W)泵浦Ti\:藍(lán)寶石振蕩器,調(diào)諧范圍約在700～1000 nm,平均功率為1～2 W,脈沖寬度約為100 fs,并通過(guò)λ/2和λ/4波片對(duì)入射光的相位進(jìn)行調(diào)節(jié)。SHG信號(hào)的收集方法可分為前向檢測(cè)和后向檢測(cè)兩種方法,普遍被使用的是后向檢測(cè)。為了避免其他波段光的影響,保證收集的信號(hào)為SHG信號(hào),必須使用濾光片過(guò)濾掉干擾信號(hào)。偏振方向?qū)τ诔上窠Y(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響,Chen等[14]對(duì)比了線偏振光和圓偏振光對(duì)膠原蛋白纖維激發(fā)得到的SHG圖像,發(fā)現(xiàn)圓偏振光可以均勻地激發(fā)所有方向,而線偏振光更適用于研究纖維的排列方向。3 二次諧波的產(chǎn)生介質(zhì)及其成像特點(diǎn)

在生物醫(yī)學(xué)成像研究中,滿足以上要求且能產(chǎn)生二次諧波信號(hào)的介質(zhì)主要分為兩大類:生物材料和外源探針。生物結(jié)構(gòu)蛋白通常會(huì)組裝成大面積有序的且非中心對(duì)稱的結(jié)構(gòu),如膠原蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白,這些結(jié)構(gòu)高度極化,因而能產(chǎn)生SHG信號(hào)。在動(dòng)物體中,膠原蛋白家族作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,是最豐富的蛋白質(zhì)種類。纖維狀的膠原蛋白(I型和II型)是高度各向異性的,由膠原三螺旋重復(fù)結(jié)構(gòu)緊密排列,其產(chǎn)生的二次諧波為研究學(xué)者提供了相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。二次諧波是偏振敏感的,對(duì)于許多SHG信號(hào)源的結(jié)構(gòu)蛋白來(lái)說(shuō),產(chǎn)生的信號(hào)量與入射激光的偏振狀態(tài)有關(guān)。若光平行于纖維結(jié)構(gòu)(z軸)偏振,則觀察到的SHG信號(hào)最強(qiáng);若垂直于纖維結(jié)構(gòu)(x軸)偏振,則觀察到的SHG信號(hào)最弱:如圖3所示。這一特點(diǎn)意味著,可以通過(guò)測(cè)量SHG信號(hào)的偏振依賴性來(lái)研究組織內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白的排列取向。除了生命體中部分組織和結(jié)構(gòu)能受激產(chǎn)生內(nèi)源性二次諧波信號(hào),大多數(shù)體內(nèi)組織和細(xì)胞均無(wú)法產(chǎn)生足夠強(qiáng)度以供檢測(cè)的二次諧波。為了增強(qiáng)信號(hào),采用一些納米探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,這是目前二次諧波活細(xì)胞及活體組織成像的一種通行辦法�；诙沃C波產(chǎn)生介質(zhì)的特點(diǎn),已開發(fā)了各種無(wú)機(jī)二次諧波納米晶,如KNbO3、BaTiO3和BiFeO3等[15-19]。無(wú)機(jī)納米晶體的SHG信號(hào)光譜帶寬窄,易于辨析。除了無(wú)機(jī)材料外,有機(jī)材料也顯現(xiàn)出極好的二次諧波性質(zhì)[20-24]。用于SHG成像的有機(jī)染料在設(shè)計(jì)時(shí)需要微調(diào)分子性質(zhì),使其發(fā)色團(tuán)在激發(fā)波長(zhǎng)下具有較高的極化率。有機(jī)化合物的非線性效應(yīng)是由于非局域的π電子受激發(fā)所致,因此強(qiáng)極性的π共軛體系組成的分子表現(xiàn)出最高的二次超極化率。此外,分子的排序也很重要,如在生物膜上規(guī)則的分子排列能增強(qiáng)染料的SHG信號(hào)強(qiáng)度。表1 中列舉了應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像研究的二次諧波探針,及其二階極化率χ(2)=β和二階極化率最大波長(zhǎng)λmax,表中esu為高斯單位制,其表示二階極化率的單位為(107 cm3·J-1)1/2。


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