基于金屬有機(jī)骨架材料檢測蛋白激酶和磷酸酶活性的熒光分析
發(fā)布時(shí)間：2021-10-08 12:15
蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者。具有催化功能的酶蛋白與人體細(xì)胞的生長發(fā)育、新陳代謝等生命活動密切相關(guān)。蛋白激酶和蛋白磷酸酶相互調(diào)控的可逆磷酸化在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用,二者的活性異常將導(dǎo)致人體產(chǎn)生多種疾病。對蛋白激酶和蛋白磷酸酶的分析檢測將極大促進(jìn)相關(guān)的基礎(chǔ)研究和以相應(yīng)的酶為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)。因此,開發(fā)操作簡便、成本低、靈敏度高的檢測方法有著重要的研究意義和廣闊的應(yīng)用前景。研究了一種基于鈦基金屬有機(jī)骨架（MOF,Ti-MIL125-NH2）對蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）進(jìn)行活性分析和抑制劑篩選的熒光分析法。該方法利用了Ti-MIL125-NH2對磷酸基團(tuán)的高度特異性識別。在加入PKA后,熒光基團(tuán)標(biāo)記的底物多肽被磷酸化,生成的磷酸化多肽可以與Ti-MIL125-NH2的鈦位點(diǎn)特異性配位結(jié)合。這導(dǎo)致了熒光富集,通過熒光光譜儀可以有效地檢測到該熒光。經(jīng)過對實(shí)驗(yàn)體系的優(yōu)化（包括乙腈占比、ATP濃度、洗脫條件、材料與磷酸化體系孵育時(shí)間）,該方法在0.00005-0.01 UμL-1范圍...
【文章來源】：河北大學(xué)河北省
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
蛋白質(zhì)的可逆磷酸化示意圖
第一章緒論3影響。通過催化磷酸化反應(yīng)，PKA在大多數(shù)細(xì)胞的發(fā)育分化、新陳代謝、基因表達(dá)等重要生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[9]。cAMP依賴性蛋白激酶的催化過程如圖1-2所示，PKA全酶由4個(gè)亞基組成，包括2個(gè)調(diào)節(jié)亞基（Regulatorysubunit）和2個(gè)催化亞基（Catalyticsubunit）。PKA在全酶狀態(tài)下不具備催化底物蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)的能力。只有當(dāng)cAMP被釋放，cAMP和PKA的催化亞基結(jié)合成復(fù)合物后，催化亞基才得以分離，從而具備催化底物蛋白發(fā)生磷酸化的能力。圖1-2cAMP依賴性蛋白激酶的激活機(jī)理示意圖Fig.1-2SchematicdiagramofactivationmechanismofcAMP-dependentproteinkinase.本文第二章著眼科研熱點(diǎn)，以PKA作為分析的對象，建立了一種熒光檢測方法來對PKA的活性進(jìn)行檢測，同時(shí)也進(jìn)行了抑制劑的篩選，取得了良好的性能表現(xiàn)。需要說明的是，本文第二章用于做線性回歸方程的商業(yè)PKA是具有催化活性的PKA催化亞基，無需通過cAMP的結(jié)合激活作用即可在ATP、Mg2+和適宜的催化環(huán)境下催化底物蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)。1.2蛋白激酶活性檢測方法蛋白激酶作為一種重要的生物分子，對它進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的檢測是至關(guān)重要的。目前，已有多種微量分析技術(shù)和高端儀器應(yīng)用到蛋白激酶的活性分析中，如放射性同位素標(biāo)記法[10,11]、比色法[12,13]、質(zhì)譜法[14,15]、電化學(xué)法[16,17]等。雖然這些方法已經(jīng)成功地用于蛋白激酶的活性檢測和抑制劑的篩選，但這些方法或多或少存在一些不足之處。例如檢測方法的線性范圍窄、搭建檢測平臺費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢測平臺需要高端昂貴儀器的支持等。因此對蛋白激酶相關(guān)分析方法的繼續(xù)研究和不斷更新是非常必要的。下面按照不同的分析方法簡述目前對蛋白激酶的檢測。
河北大學(xué)碩士學(xué)位論文41.2.1放射性同位素標(biāo)記法放射性同位素標(biāo)記法（Radioisotopiclabeling），是檢測蛋白激酶活性的經(jīng)典方法。這種檢測方法使用了放射性同位素32P或33P。由于放射性同位素的背景干擾孝靈敏度高，放射性同位素標(biāo)記法對蛋白激酶的檢測結(jié)果非常準(zhǔn)確，因而也被稱為蛋白激酶檢測方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。其具體的檢測原理如圖1-3所示，32P由于是P的同位素，所以具有幾乎相同的化學(xué)性質(zhì)。在合成過程中，通過將放射性同位素32P連接到ATP的γ位來生成放射性同位素標(biāo)記的[γ-32P]ATP。經(jīng)過蛋白激酶的催化，[γ-32P]ATPγ位的32P被轉(zhuǎn)移到底物多肽特定的氨基酸殘基上。再通過后續(xù)的分離方法，將帶有32P標(biāo)記的磷酸化多肽分離出來，同時(shí)將未參與反應(yīng)的[γ-32P]ATP洗脫[10]。最后通過放射性物質(zhì)探測儀器即可進(jìn)行檢測并由此測得蛋白激酶的活性。圖1-3放射性同位素標(biāo)記法原理示意圖Fig.1-3Schematicdiagramofradioisotopiclabeling.放射性同位素標(biāo)記法方法簡便，而且檢測結(jié)果具有極高的可靠性，為蛋白激酶的相關(guān)研究起到很大幫助，但這種方法也有一些不可避免的缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)主要是：（1）放射性同位素32P/33P的半衰期短，需要及時(shí)更新試劑以確保結(jié)果的準(zhǔn)確；（2）放射性同位素對環(huán)境有污染，對人體健康有危害。雖然放射性同位素標(biāo)記法是蛋白激酶檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但它的弊端卻限制了其的廣泛應(yīng)用。近年來，放射性同位素標(biāo)記法已經(jīng)逐漸被新發(fā)展的其他檢測手段所代替。1.2.2免疫反應(yīng)法近年來多種非放射性的方法逐漸應(yīng)用到蛋白激酶的活性分析上來。其中，免疫反應(yīng)法（Immunoassay）就是一種比較常用的方法。免疫反應(yīng)法的基本原理是抗原抗體反應(yīng)。
本文編號：3424139
【文章來源】：河北大學(xué)河北省
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
蛋白質(zhì)的可逆磷酸化示意圖
第一章緒論3影響。通過催化磷酸化反應(yīng)，PKA在大多數(shù)細(xì)胞的發(fā)育分化、新陳代謝、基因表達(dá)等重要生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[9]。cAMP依賴性蛋白激酶的催化過程如圖1-2所示，PKA全酶由4個(gè)亞基組成，包括2個(gè)調(diào)節(jié)亞基（Regulatorysubunit）和2個(gè)催化亞基（Catalyticsubunit）。PKA在全酶狀態(tài)下不具備催化底物蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)的能力。只有當(dāng)cAMP被釋放，cAMP和PKA的催化亞基結(jié)合成復(fù)合物后，催化亞基才得以分離，從而具備催化底物蛋白發(fā)生磷酸化的能力。圖1-2cAMP依賴性蛋白激酶的激活機(jī)理示意圖Fig.1-2SchematicdiagramofactivationmechanismofcAMP-dependentproteinkinase.本文第二章著眼科研熱點(diǎn)，以PKA作為分析的對象，建立了一種熒光檢測方法來對PKA的活性進(jìn)行檢測，同時(shí)也進(jìn)行了抑制劑的篩選，取得了良好的性能表現(xiàn)。需要說明的是，本文第二章用于做線性回歸方程的商業(yè)PKA是具有催化活性的PKA催化亞基，無需通過cAMP的結(jié)合激活作用即可在ATP、Mg2+和適宜的催化環(huán)境下催化底物蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)。1.2蛋白激酶活性檢測方法蛋白激酶作為一種重要的生物分子，對它進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的檢測是至關(guān)重要的。目前，已有多種微量分析技術(shù)和高端儀器應(yīng)用到蛋白激酶的活性分析中，如放射性同位素標(biāo)記法[10,11]、比色法[12,13]、質(zhì)譜法[14,15]、電化學(xué)法[16,17]等。雖然這些方法已經(jīng)成功地用于蛋白激酶的活性檢測和抑制劑的篩選，但這些方法或多或少存在一些不足之處。例如檢測方法的線性范圍窄、搭建檢測平臺費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢測平臺需要高端昂貴儀器的支持等。因此對蛋白激酶相關(guān)分析方法的繼續(xù)研究和不斷更新是非常必要的。下面按照不同的分析方法簡述目前對蛋白激酶的檢測。
河北大學(xué)碩士學(xué)位論文41.2.1放射性同位素標(biāo)記法放射性同位素標(biāo)記法（Radioisotopiclabeling），是檢測蛋白激酶活性的經(jīng)典方法。這種檢測方法使用了放射性同位素32P或33P。由于放射性同位素的背景干擾孝靈敏度高，放射性同位素標(biāo)記法對蛋白激酶的檢測結(jié)果非常準(zhǔn)確，因而也被稱為蛋白激酶檢測方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。其具體的檢測原理如圖1-3所示，32P由于是P的同位素，所以具有幾乎相同的化學(xué)性質(zhì)。在合成過程中，通過將放射性同位素32P連接到ATP的γ位來生成放射性同位素標(biāo)記的[γ-32P]ATP。經(jīng)過蛋白激酶的催化，[γ-32P]ATPγ位的32P被轉(zhuǎn)移到底物多肽特定的氨基酸殘基上。再通過后續(xù)的分離方法，將帶有32P標(biāo)記的磷酸化多肽分離出來，同時(shí)將未參與反應(yīng)的[γ-32P]ATP洗脫[10]。最后通過放射性物質(zhì)探測儀器即可進(jìn)行檢測并由此測得蛋白激酶的活性。圖1-3放射性同位素標(biāo)記法原理示意圖Fig.1-3Schematicdiagramofradioisotopiclabeling.放射性同位素標(biāo)記法方法簡便，而且檢測結(jié)果具有極高的可靠性，為蛋白激酶的相關(guān)研究起到很大幫助，但這種方法也有一些不可避免的缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)主要是：（1）放射性同位素32P/33P的半衰期短，需要及時(shí)更新試劑以確保結(jié)果的準(zhǔn)確；（2）放射性同位素對環(huán)境有污染，對人體健康有危害。雖然放射性同位素標(biāo)記法是蛋白激酶檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但它的弊端卻限制了其的廣泛應(yīng)用。近年來，放射性同位素標(biāo)記法已經(jīng)逐漸被新發(fā)展的其他檢測手段所代替。1.2.2免疫反應(yīng)法近年來多種非放射性的方法逐漸應(yīng)用到蛋白激酶的活性分析上來。其中，免疫反應(yīng)法（Immunoassay）就是一種比較常用的方法。免疫反應(yīng)法的基本原理是抗原抗體反應(yīng)。
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