蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者。具有催化功能的酶蛋白與人體細胞的生長發(fā)育、新陳代謝等生命活動密切相關(guān)。蛋白激酶和蛋白磷酸酶相互調(diào)控的可逆磷酸化在信號轉(zhuǎn)導中起著至關(guān)重要的作用,二者的活性異常將導致人體產(chǎn)生多種疾病。對蛋白激酶和蛋白磷酸酶的分析檢測將極大促進相關(guān)的基礎研究和以相應的酶為靶點的藥物研發(fā)。因此,開發(fā)操作簡便、成本低、靈敏度高的檢測方法有著重要的研究意義和廣闊的應用前景。研究了一種基于鈦基金屬有機骨架（MOF,Ti-MIL125-NH₂）對蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）進行活性分析和抑制劑篩選的熒光分析法。該方法利用了Ti-MIL125-NH₂對磷酸基團的高度特異性識別。在加入PKA后,熒光基團標記的底物多肽被磷酸化,生成的磷酸化多肽可以與Ti-MIL125-NH₂的鈦位點特異性配位結(jié)合。這導致了熒光富集,通過熒光光譜儀可以有效地檢測到該熒光。經(jīng)過對實驗體系的優(yōu)化（包括乙腈占比、ATP濃度、洗脫條件、材料與磷酸化體系孵育時間）,該方法在0.00005-0.01 UμL^-1范圍... 

【文章來源】：河北大學河北省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

蛋白質(zhì)的可逆磷酸化示意圖

第一章緒論3影響。通過催化磷酸化反應，PKA在大多數(shù)細胞的發(fā)育分化、新陳代謝、基因表達等重要生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[9]。cAMP依賴性蛋白激酶的催化過程如圖1-2所示，PKA全酶由4個亞基組成，包括2個調(diào)節(jié)亞基（Regulatorysubunit）和2個催化亞基（Catalyticsubunit）。PKA在全酶狀態(tài)下不具備催化底物蛋白發(fā)生磷酸化反應的能力。只有當cAMP被釋放，cAMP和PKA的催化亞基結(jié)合成復合物后，催化亞基才得以分離，從而具備催化底物蛋白發(fā)生磷酸化的能力。圖1-2cAMP依賴性蛋白激酶的激活機理示意圖Fig.1-2SchematicdiagramofactivationmechanismofcAMP-dependentproteinkinase.本文第二章著眼科研熱點，以PKA作為分析的對象，建立了一種熒光檢測方法來對PKA的活性進行檢測，同時也進行了抑制劑的篩選，取得了良好的性能表現(xiàn)。需要說明的是，本文第二章用于做線性回歸方程的商業(yè)PKA是具有催化活性的PKA催化亞基，無需通過cAMP的結(jié)合激活作用即可在ATP、Mg2+和適宜的催化環(huán)境下催化底物蛋白發(fā)生磷酸化反應。1.2蛋白激酶活性檢測方法蛋白激酶作為一種重要的生物分子，對它進行準確、高效的檢測是至關(guān)重要的。目前，已有多種微量分析技術(shù)和高端儀器應用到蛋白激酶的活性分析中，如放射性同位素標記法[10,11]、比色法[12,13]、質(zhì)譜法[14,15]、電化學法[16,17]等。雖然這些方法已經(jīng)成功地用于蛋白激酶的活性檢測和抑制劑的篩選，但這些方法或多或少存在一些不足之處。例如檢測方法的線性范圍窄、搭建檢測平臺費時費力、檢測平臺需要高端昂貴儀器的支持等。因此對蛋白激酶相關(guān)分析方法的繼續(xù)研究和不斷更新是非常必要的。下面按照不同的分析方法簡述目前對蛋白激酶的檢測。

河北大學碩士學位論文41.2.1放射性同位素標記法放射性同位素標記法（Radioisotopiclabeling），是檢測蛋白激酶活性的經(jīng)典方法。這種檢測方法使用了放射性同位素32P或33P。由于放射性同位素的背景干擾孝靈敏度高，放射性同位素標記法對蛋白激酶的檢測結(jié)果非常準確，因而也被稱為蛋白激酶檢測方法的“金標準”。其具體的檢測原理如圖1-3所示，32P由于是P的同位素，所以具有幾乎相同的化學性質(zhì)。在合成過程中，通過將放射性同位素32P連接到ATP的γ位來生成放射性同位素標記的[γ-32P]ATP。經(jīng)過蛋白激酶的催化，[γ-32P]ATPγ位的32P被轉(zhuǎn)移到底物多肽特定的氨基酸殘基上。再通過后續(xù)的分離方法，將帶有32P標記的磷酸化多肽分離出來，同時將未參與反應的[γ-32P]ATP洗脫[10]。最后通過放射性物質(zhì)探測儀器即可進行檢測并由此測得蛋白激酶的活性。圖1-3放射性同位素標記法原理示意圖Fig.1-3Schematicdiagramofradioisotopiclabeling.放射性同位素標記法方法簡便，而且檢測結(jié)果具有極高的可靠性，為蛋白激酶的相關(guān)研究起到很大幫助，但這種方法也有一些不可避免的缺點。這些缺點主要是：（1）放射性同位素32P/33P的半衰期短，需要及時更新試劑以確保結(jié)果的準確；（2）放射性同位素對環(huán)境有污染，對人體健康有危害。雖然放射性同位素標記法是蛋白激酶檢測的“金標準”，但它的弊端卻限制了其的廣泛應用。近年來，放射性同位素標記法已經(jīng)逐漸被新發(fā)展的其他檢測手段所代替。1.2.2免疫反應法近年來多種非放射性的方法逐漸應用到蛋白激酶的活性分析上來。其中，免疫反應法（Immunoassay）就是一種比較常用的方法。免疫反應法的基本原理是抗原抗體反應。


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