納米羥基磷灰石—?dú)ぞ厶呛蜌ぞ厶侵Ъ懿牧袭愇怀晒堑膶Ρ妊芯?/H1>
發(fā)布時間：2017-05-02 20:14
本文關(guān)鍵詞：納米羥基磷灰石—?dú)ぞ厶呛蜌ぞ厶侵Ъ懿牧袭愇怀晒堑膶Ρ妊芯?/strong>，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
【摘要】：目的：(DPercoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),為組織工程骨的構(gòu)建提供種子細(xì)胞。②對比評價納米羥基磷灰石-殼聚糖(nano-hydroxyapatite-chitosan, nHA-CS)和殼聚糖(chitosan, CS)支架與大鼠BMSCs的生物相容性。③評價大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后的成骨分化性能。④對比評價納米羥基磷灰石-殼聚糖和殼聚糖支架材料的異位成骨能力。 方法：①無菌分離8周齡健康SD大鼠股骨,沖洗骨髓腔獲取骨髓,采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得形態(tài)較為單一的貼壁細(xì)胞。②將實(shí)驗(yàn)分為nHA-CS組、CS組以及對照組,采用計數(shù)法測定接種2h、4h、6h、8h、12h后的細(xì)胞粘附率,細(xì)胞粘附率=(接種細(xì)胞數(shù)-未粘附細(xì)胞數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)；采用CCK-8法測定細(xì)胞的生長曲線；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在支架周圍的生長情況；激光共聚焦顯微鏡掃描觀察細(xì)胞在支架上的粘附生長狀況。③在P3代BMSCs成骨誘導(dǎo)后3d,對其行鈣-鈷染色,檢測細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)；成骨誘導(dǎo)后21天對其行Von Kossa染色和茜素紅染色,檢測細(xì)胞外鈣鹽沉積。④采用2月齡SPS級健康SD雄性大鼠65只,體重186.4g～217.5g,平均(202.9±7.2)g,將其隨機(jī)分為五組：Ⅰ組為細(xì)胞復(fù)合nHA-CS支架組,Ⅱ組為細(xì)胞復(fù)合CS支架組,Ⅲ組為單純nHA-CS支架組,Ⅳ組為單純CS支架組,V組為空白對照組。將內(nèi)植物植入大鼠肌袋內(nèi),分別于術(shù)后2、4、6、8、12周對大鼠股骨行CT掃描,組織標(biāo)本切片HE染色和Masson染色以評估支架異位成骨情況。 結(jié)果：①采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得大量形態(tài)較為均一,呈梭形和成纖維形,方向性排列的貼壁細(xì)胞。②nHA-CS組、CS組以及無支架對照組,接種2h、4h、6h、8h、2h后的細(xì)胞平均粘附率分別為：(80.23±4.73)%、(84.48±5.17)%、(86.77±3.10)%、(86.77±3.10)%、(88.02±2.07)%；(78.49±5.25)%、(83.12±5.45)%、(83.12±5.45)%、(87.04±3.95)%、(87.04±3.95)%：(84.42±4.27)%、(87.04±3.20)%、(89.38±3.02)%、(90.69±2.48)%、(90.69±2.48)%。統(tǒng)計分析顯示在各個時間點(diǎn)細(xì)胞粘附率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。細(xì)胞接種后1-4天nHA-CS組、CS組以及對照組細(xì)胞按照正常速度增殖,第5天細(xì)胞增殖速度有所下降,至6-9天三組細(xì)胞增殖速度均明顯減緩,出現(xiàn)細(xì)胞增殖平臺。三組曲線整體趨勢相同,呈現(xiàn)“S”形。細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)24h后,nHA-CS支架和CS支架周圍均可見細(xì)胞圍繞支架邊緣貼壁生長,細(xì)胞呈梭形,鏡下透亮度高,細(xì)胞狀態(tài)良好。激光共聚焦顯微鏡掃描見細(xì)胞接種48h后大量細(xì)胞粘附于nHA-CS支架和CS支架孔壁之上。③成骨誘導(dǎo)3d后,鈣-鈷法染色見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量黑色顆粒狀沉積,顯示細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)；誘導(dǎo)21d后,Von Kossa法染色和茜素紅染色,分別見細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)褐色和紅色鈣結(jié)節(jié)。④術(shù)后CT示各組植入物均位于大腿肌肉組織內(nèi)靠近股骨。在術(shù)后第2周nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組和CS復(fù)合細(xì)胞組即可見新生骨組織形成,而單純CS組則在6周以后才見新生骨形成。各組植入部位新骨形成隨時間的延長而逐漸增加,并且在同一時間點(diǎn)nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組的新骨形成要明顯多于單純nHA-CS組,CS復(fù)合細(xì)胞組明顯多于單純CS組。HE染色示2周時各組支架孔隙內(nèi)骨樣組織沉積,隨時間延長,骨樣組織逐漸增多,軟骨樣組織形成,骨化逐漸發(fā)生。對各組不同時間點(diǎn)的骨面積分?jǐn)?shù)和支架剩余面積分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)：各組的骨面積分?jǐn)?shù)隨著時間的延長分別逐漸增加(P0.05),在相同時間點(diǎn),各組的骨面積分?jǐn)?shù)均有差異,nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組最高,其次分別為CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組、單純CS組(P0.05)；而隨時間延長各組的支架剩余分?jǐn)?shù)分別逐漸降低(P0.05),在相同時間點(diǎn),單純CS組的支架剩余面積分?jǐn)?shù)最高,其次分別為單純nHA-CS組、CS復(fù)合細(xì)胞組、nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組(P0.05)。Masson染色顯示膠原蛋白首先在骨樣沉積組織之間產(chǎn)生,后逐漸增多交織呈網(wǎng)狀、板層狀,構(gòu)成成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。統(tǒng)計分析膠原面積分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)：隨時間增加,各組膠原面積分?jǐn)?shù)逐漸增加(P0.05)；在相同時間點(diǎn),不同組之間的膠原面積分?jǐn)?shù)以nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組最高,其次分別為CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組、單純CS組(P0.05)。 結(jié)論：①Percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法是一種理想的分離BMSCs的方法。②nHA-CS支架和CS支架與BMSCs之間均均有良好的體外生物相容性,二者在對細(xì)胞生長的影響、細(xì)胞粘附效率等方面均無明顯差異。③采用含有10-8mol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸鈉和50mg/L維生素C的完全培養(yǎng)基作為成骨誘導(dǎo)體系,能夠成功誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化,誘導(dǎo)后細(xì)胞具有良好的成骨性能。④nHA-CS支架和CS支架復(fù)合成骨誘導(dǎo)后的BMSCs均具有優(yōu)良的異位成骨能力,但nHA-CS支架的成骨性能明顯優(yōu)于CS支架,可作為優(yōu)秀的骨組織工程修復(fù)材料
【關(guān)鍵詞】：異位成骨 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 納米羥基磷灰石-殼聚糖 殼聚糖
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08;R687
【目錄】： - 中英文縮寫一覽表4-5
- 中文摘要5-7
- 英文摘要7-10
- 前言10-14
- 第一部分 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)14-19
- 材料與方法14-16
- 實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-17
- 討論17-18
- 結(jié)論18-19
- 第二部分 nHA-CS和CS支架細(xì)胞相容性的對比研究19-28
- 材料與方法19-21
- 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
- 討論26-27
- 結(jié)論27-28
- 第三部分 大鼠BMSCs的成骨誘導(dǎo)及鑒定28-35
- 材料與方法28-29
- 結(jié)果29-32
- 討論32-33
- 結(jié)論33-35
- 第四部分 經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs復(fù)合nHA-CS和CS支架異位成骨的對比研究35-53
- 材料與方法35-38
- 結(jié)果38-49
- 討論49-51
- 結(jié)論51-53
- 全文總結(jié)53-54
- 參考文獻(xiàn)54-65
- 綜述65-77
- 參考文獻(xiàn)71-77
- 論著77-95
- 碩士期間論文情況95-96
- 致謝96-97
【參考文獻(xiàn)】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條
1 張洪濤;劉康;蔡道章;曾毅軍;蔡榮輝;陳爾東;何志勇;余新平;安寧;王金軍;;富血小板血漿誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)異位成骨[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年01期
2 廖慶輝;黃震;蔡德鴻;;抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年01期
3 王佳南;張曉剛;湯為學(xué);鄭麗娜;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)條件[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年14期
4 劉順振;侯玉東;;骨組織工程支架材料的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年42期
5 佘榮峰;鄧江;黃文良;董志軍;劉彬;;絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架材料的細(xì)胞相容性[J];中國組織工程研究;2012年03期
6 寧志剛;楊柳;;膠原蛋白水凝膠在軟骨組織工程中的應(yīng)用[J];中國骨傷;2011年10期
7 韓明;袁芳;董麗萍;師忠芳;袁輝;楊少華;;人腦多形性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系BT325對5種抗腫瘤藥物敏感性的研究[J];中國康復(fù)理論與實(shí)踐;2011年09期
8 徐紅珍;蘇儉生;;組織工程骨的血管化研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年04期
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本文編號：341627
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【摘要】：目的：(DPercoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),為組織工程骨的構(gòu)建提供種子細(xì)胞。②對比評價納米羥基磷灰石-殼聚糖(nano-hydroxyapatite-chitosan, nHA-CS)和殼聚糖(chitosan, CS)支架與大鼠BMSCs的生物相容性。③評價大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后的成骨分化性能。④對比評價納米羥基磷灰石-殼聚糖和殼聚糖支架材料的異位成骨能力。 方法：①無菌分離8周齡健康SD大鼠股骨,沖洗骨髓腔獲取骨髓,采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得形態(tài)較為單一的貼壁細(xì)胞。②將實(shí)驗(yàn)分為nHA-CS組、CS組以及對照組,采用計數(shù)法測定接種2h、4h、6h、8h、12h后的細(xì)胞粘附率,細(xì)胞粘附率=(接種細(xì)胞數(shù)-未粘附細(xì)胞數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)；采用CCK-8法測定細(xì)胞的生長曲線；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在支架周圍的生長情況；激光共聚焦顯微鏡掃描觀察細(xì)胞在支架上的粘附生長狀況。③在P3代BMSCs成骨誘導(dǎo)后3d,對其行鈣-鈷染色,檢測細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)；成骨誘導(dǎo)后21天對其行Von Kossa染色和茜素紅染色,檢測細(xì)胞外鈣鹽沉積。④采用2月齡SPS級健康SD雄性大鼠65只,體重186.4g～217.5g,平均(202.9±7.2)g,將其隨機(jī)分為五組：Ⅰ組為細(xì)胞復(fù)合nHA-CS支架組,Ⅱ組為細(xì)胞復(fù)合CS支架組,Ⅲ組為單純nHA-CS支架組,Ⅳ組為單純CS支架組,V組為空白對照組。將內(nèi)植物植入大鼠肌袋內(nèi),分別于術(shù)后2、4、6、8、12周對大鼠股骨行CT掃描,組織標(biāo)本切片HE染色和Masson染色以評估支架異位成骨情況。 結(jié)果：①采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得大量形態(tài)較為均一,呈梭形和成纖維形,方向性排列的貼壁細(xì)胞。②nHA-CS組、CS組以及無支架對照組,接種2h、4h、6h、8h、2h后的細(xì)胞平均粘附率分別為：(80.23±4.73)%、(84.48±5.17)%、(86.77±3.10)%、(86.77±3.10)%、(88.02±2.07)%；(78.49±5.25)%、(83.12±5.45)%、(83.12±5.45)%、(87.04±3.95)%、(87.04±3.95)%：(84.42±4.27)%、(87.04±3.20)%、(89.38±3.02)%、(90.69±2.48)%、(90.69±2.48)%。統(tǒng)計分析顯示在各個時間點(diǎn)細(xì)胞粘附率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。細(xì)胞接種后1-4天nHA-CS組、CS組以及對照組細(xì)胞按照正常速度增殖,第5天細(xì)胞增殖速度有所下降,至6-9天三組細(xì)胞增殖速度均明顯減緩,出現(xiàn)細(xì)胞增殖平臺。三組曲線整體趨勢相同,呈現(xiàn)“S”形。細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)24h后,nHA-CS支架和CS支架周圍均可見細(xì)胞圍繞支架邊緣貼壁生長,細(xì)胞呈梭形,鏡下透亮度高,細(xì)胞狀態(tài)良好。激光共聚焦顯微鏡掃描見細(xì)胞接種48h后大量細(xì)胞粘附于nHA-CS支架和CS支架孔壁之上。③成骨誘導(dǎo)3d后,鈣-鈷法染色見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量黑色顆粒狀沉積,顯示細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)；誘導(dǎo)21d后,Von Kossa法染色和茜素紅染色,分別見細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)褐色和紅色鈣結(jié)節(jié)。④術(shù)后CT示各組植入物均位于大腿肌肉組織內(nèi)靠近股骨。在術(shù)后第2周nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組和CS復(fù)合細(xì)胞組即可見新生骨組織形成,而單純CS組則在6周以后才見新生骨形成。各組植入部位新骨形成隨時間的延長而逐漸增加,并且在同一時間點(diǎn)nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組的新骨形成要明顯多于單純nHA-CS組,CS復(fù)合細(xì)胞組明顯多于單純CS組。HE染色示2周時各組支架孔隙內(nèi)骨樣組織沉積,隨時間延長,骨樣組織逐漸增多,軟骨樣組織形成,骨化逐漸發(fā)生。對各組不同時間點(diǎn)的骨面積分?jǐn)?shù)和支架剩余面積分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)：各組的骨面積分?jǐn)?shù)隨著時間的延長分別逐漸增加(P0.05),在相同時間點(diǎn),各組的骨面積分?jǐn)?shù)均有差異,nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組最高,其次分別為CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組、單純CS組(P0.05)；而隨時間延長各組的支架剩余分?jǐn)?shù)分別逐漸降低(P0.05),在相同時間點(diǎn),單純CS組的支架剩余面積分?jǐn)?shù)最高,其次分別為單純nHA-CS組、CS復(fù)合細(xì)胞組、nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組(P0.05)。Masson染色顯示膠原蛋白首先在骨樣沉積組織之間產(chǎn)生,后逐漸增多交織呈網(wǎng)狀、板層狀,構(gòu)成成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。統(tǒng)計分析膠原面積分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)：隨時間增加,各組膠原面積分?jǐn)?shù)逐漸增加(P0.05)；在相同時間點(diǎn),不同組之間的膠原面積分?jǐn)?shù)以nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組最高,其次分別為CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組、單純CS組(P0.05)。 結(jié)論：①Percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法是一種理想的分離BMSCs的方法。②nHA-CS支架和CS支架與BMSCs之間均均有良好的體外生物相容性,二者在對細(xì)胞生長的影響、細(xì)胞粘附效率等方面均無明顯差異。③采用含有10-8mol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸鈉和50mg/L維生素C的完全培養(yǎng)基作為成骨誘導(dǎo)體系,能夠成功誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化,誘導(dǎo)后細(xì)胞具有良好的成骨性能。④nHA-CS支架和CS支架復(fù)合成骨誘導(dǎo)后的BMSCs均具有優(yōu)良的異位成骨能力,但nHA-CS支架的成骨性能明顯優(yōu)于CS支架,可作為優(yōu)秀的骨組織工程修復(fù)材料
【關(guān)鍵詞】：異位成骨 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 納米羥基磷灰石-殼聚糖 殼聚糖
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08;R687
【目錄】：
- 中英文縮寫一覽表4-5
- 中文摘要5-7
- 英文摘要7-10
- 前言10-14
- 第一部分 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)14-19
- 材料與方法14-16
- 實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-17
- 討論17-18
- 結(jié)論18-19
- 第二部分 nHA-CS和CS支架細(xì)胞相容性的對比研究19-28
- 材料與方法19-21
- 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
- 討論26-27
- 結(jié)論27-28
- 第三部分 大鼠BMSCs的成骨誘導(dǎo)及鑒定28-35
- 材料與方法28-29
- 結(jié)果29-32
- 討論32-33
- 結(jié)論33-35
- 第四部分 經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs復(fù)合nHA-CS和CS支架異位成骨的對比研究35-53
- 材料與方法35-38
- 結(jié)果38-49
- 討論49-51
- 結(jié)論51-53
- 全文總結(jié)53-54
- 參考文獻(xiàn)54-65
- 綜述65-77
- 參考文獻(xiàn)71-77
- 論著77-95
- 碩士期間論文情況95-96
- 致謝96-97
【參考文獻(xiàn)】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條
1 張洪濤;劉康;蔡道章;曾毅軍;蔡榮輝;陳爾東;何志勇;余新平;安寧;王金軍;;富血小板血漿誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)異位成骨[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年01期
2 廖慶輝;黃震;蔡德鴻;;抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年01期
3 王佳南;張曉剛;湯為學(xué);鄭麗娜;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)條件[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年14期
4 劉順振;侯玉東;;骨組織工程支架材料的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年42期
5 佘榮峰;鄧江;黃文良;董志軍;劉彬;;絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架材料的細(xì)胞相容性[J];中國組織工程研究;2012年03期
6 寧志剛;楊柳;;膠原蛋白水凝膠在軟骨組織工程中的應(yīng)用[J];中國骨傷;2011年10期
7 韓明;袁芳;董麗萍;師忠芳;袁輝;楊少華;;人腦多形性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系BT325對5種抗腫瘤藥物敏感性的研究[J];中國康復(fù)理論與實(shí)踐;2011年09期
8 徐紅珍;蘇儉生;;組織工程骨的血管化研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年04期
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本文編號：341627
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