低溫保存可減緩細(xì)胞代謝,延長其體外存活時(shí)間,是生物人工肝存儲和運(yùn)輸?shù)睦硐敕绞�。但低溫保存過程易引發(fā)細(xì)胞損傷,制約了生物人工肝的臨床應(yīng)用。因此,設(shè)計(jì)合適的保護(hù)策略以抑制低溫保存中的細(xì)胞損傷,是確保生物人工肝廣泛應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。本論文基于微型化的中空纖維型生物人工肝,通過對低溫保存保護(hù)劑的篩選、保護(hù)劑作用機(jī)理及低溫?fù)p傷機(jī)理的研究,并結(jié)合保護(hù)劑在反應(yīng)器內(nèi)的傳質(zhì)分析,提出生物人工肝低溫保存的新方法。通過對低溫保存保護(hù)劑篩選發(fā)現(xiàn),甘草酸二銨、維生素E、海藻糖和苦參堿對細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用。低溫保存中的微型化生物人工肝經(jīng)這四種保護(hù)劑聯(lián)合處理后,其細(xì)胞活率和胞內(nèi)谷胱甘肽水平與未經(jīng)保護(hù)劑處理相比,分別提高了約38%和32%。隨后,對作用機(jī)理已知的保護(hù)劑進(jìn)行歸納總結(jié)可知,預(yù)培養(yǎng)階段發(fā)揮功效的保護(hù)劑主要為抗氧化劑,低溫階段主要為細(xì)胞膜保護(hù)劑和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變抑制劑,而復(fù)溫階段主要為抗氧化劑、線粒體鈣離子通道阻滯劑和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變抑制劑。同時(shí),采用1,6-二磷酸果糖提高胞內(nèi)ATP含量后仍不能阻止細(xì)胞損傷的發(fā)生,證明了ATP缺失不是引發(fā)低溫?fù)p傷的初始誘因。此外,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),雙鼠李糖脂在低溫階段通過增加細(xì)... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 生物人工肝概述
    1.2 肝細(xì)胞的低溫保存和超低溫保存
        1.2.1 低溫保存及其保護(hù)劑
        1.2.2 低溫?fù)p傷機(jī)理
        1.2.3 超低溫保存
    1.3 中空纖維型生物人工肝的傳質(zhì)研究
        1.3.1 反應(yīng)器傳質(zhì)特點(diǎn)及其研究現(xiàn)狀
        1.3.2 中空纖維膜擴(kuò)散系數(shù)的獲得方法
        1.3.3 微電極技術(shù)及其在傳質(zhì)檢測中的應(yīng)用
    1.4 研究思路
第二章 材料與方法
    2.1 動物
    2.2 試劑與器材
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要器材
    2.3 培養(yǎng)基與所用溶液配方
        2.3.1 大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)基
        2.3.2 低溫保存培養(yǎng)基
        2.3.3 4×濃縮培養(yǎng)基
        2.3.4 磷酸緩沖液(PBS)
        2.3.5 細(xì)胞洗滌培養(yǎng)基
    2.4 大鼠肝細(xì)胞收獲方法
    2.5 細(xì)胞培養(yǎng)方法
        2.5.1 單層貼壁培養(yǎng)
        2.5.2 中空纖維凝膠包埋培養(yǎng)
        2.5.3 中空纖維柱狀聚集體培養(yǎng)
    2.6 低溫保存方法
    2.7 超低溫保存方法
    2.8 細(xì)胞相關(guān)功能分析
        2.8.1 細(xì)胞活率檢測
        2.8.2 尿素含量分析
        2.8.3 白蛋白分析
        2.8.4 線粒體膜電位檢測
        2.8.5 活性氧自由基檢測
        2.8.6 胞內(nèi)谷胱甘肽測定
        2.8.7 胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度(Ca~(2+))測定
        2.8.8 細(xì)胞CYP 450活性測定
        2.8.9 胞內(nèi)海藻糖濃度測定
        2.8.10 PCR基因檢測
        2.8.11 膠原凝膠收縮率測定
    2.9 中空纖維膜形貌及滲透特性表征
        2.9.1 掃描電極觀察中空纖維膜形貌
        2.9.2 中空纖維膜滲透特性表征
    2.10 傳質(zhì)相關(guān)測定及分析方法
        2.10.1 針形微電極制備
        2.10.2 微電極表面抗污染膜涂布
        2.10.3 平板膜擴(kuò)散系數(shù)測定
        2.10.4 微電極檢測中空纖維膜擴(kuò)散系數(shù)
        2.10.5 微型化透析裝置測定中空纖維膜擴(kuò)散系數(shù)
        2.10.6 微電極測定膠原-細(xì)胞混合物的擴(kuò)散系數(shù)
    2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
第三章 微型化生物人工肝的低溫保存
    3.1 肝細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化
    3.2 低溫保存保護(hù)劑篩選
    3.3 保護(hù)劑合用及其使用方法的優(yōu)化
    3.4 雙鼠李糖脂的作用
    3.5 低溫保存后肝細(xì)胞功能的綜合評價(jià)
    3.6 低溫保存保護(hù)劑用于肝細(xì)胞的超低溫保存
        3.6.1 肝細(xì)胞的超低溫保存
        3.6.2 單層貼壁培養(yǎng)細(xì)胞活性評價(jià)
        3.6.3 組織化培養(yǎng)細(xì)胞活性評價(jià)
    3.7 本章小結(jié)
第四章 低溫?fù)p傷與保護(hù)劑作用機(jī)理
    4.1 有效保護(hù)劑反映低溫?fù)p傷機(jī)理
    4.2 苦參堿作用機(jī)理
        4.2.1 苦參堿在復(fù)溫階段的保護(hù)作用
        4.2.2 苦參堿在低溫階段的毒性作用
        4.2.3 苦參堿對胞內(nèi)游離鈣離子的調(diào)節(jié)作用
    4.3 雙鼠李糖脂作用機(jī)理
        4.3.1 雙鼠李糖脂單獨(dú)作用
        4.3.2 雙鼠李糖脂與海藻糖協(xié)同作用
    4.4 保護(hù)劑合用對細(xì)胞基因表達(dá)的影響
    4.5 保護(hù)劑合用對細(xì)胞骨架微絲的影響
    4.6 本章小結(jié)
第五章 基于微電極的中空纖維膜傳質(zhì)檢測方法建立
    5.1 微電極檢測物質(zhì)濃度方法的建立及可行性驗(yàn)證
        5.1.1 微電極檢測物質(zhì)濃度方法的建立
        5.1.2 微電極檢測物質(zhì)濃度隨時(shí)間變化的可行性驗(yàn)證
    5.2 中空纖維膜擴(kuò)散系數(shù)檢測方法的建立
    5.3 微電極檢測中空纖維膜擴(kuò)散系數(shù)的可靠性驗(yàn)證
        5.3.1 微型透析器法驗(yàn)證
        5.3.2 不同類型中空纖維膜定性驗(yàn)證
    5.4 本章小結(jié)
第六章 微型化生物人工肝低溫保存保護(hù)劑傳質(zhì)研究
    6.1 微電極表面抗生物污染修飾
        6.1.1 抗污染薄膜制備及其性能評價(jià)
        6.1.2 微電極涂布抗污染膜層及其性能評價(jià)
    6.2 中空纖維膜及膠原-細(xì)胞混合體系中的各種保護(hù)劑擴(kuò)散系數(shù)測定
    6.3 低溫保存保護(hù)劑在反應(yīng)器中的傳質(zhì)達(dá)穩(wěn)定所需時(shí)間
    6.4 本章小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
    7.1 總結(jié)
    7.2 不足之處
    7.3 展望
論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
作者簡歷
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
發(fā)明專利


【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3413877