低溫保存可減緩細胞代謝,延長其體外存活時間,是生物人工肝存儲和運輸的理想方式。但低溫保存過程易引發(fā)細胞損傷,制約了生物人工肝的臨床應用。因此,設計合適的保護策略以抑制低溫保存中的細胞損傷,是確保生物人工肝廣泛應用的重要基礎。本論文基于微型化的中空纖維型生物人工肝,通過對低溫保存保護劑的篩選、保護劑作用機理及低溫損傷機理的研究,并結合保護劑在反應器內的傳質分析,提出生物人工肝低溫保存的新方法。通過對低溫保存保護劑篩選發(fā)現,甘草酸二銨、維生素E、海藻糖和苦參堿對細胞具有顯著保護作用。低溫保存中的微型化生物人工肝經這四種保護劑聯(lián)合處理后,其細胞活率和胞內谷胱甘肽水平與未經保護劑處理相比,分別提高了約38%和32%。隨后,對作用機理已知的保護劑進行歸納總結可知,預培養(yǎng)階段發(fā)揮功效的保護劑主要為抗氧化劑,低溫階段主要為細胞膜保護劑和線粒體膜通透性轉變抑制劑,而復溫階段主要為抗氧化劑、線粒體鈣離子通道阻滯劑和線粒體膜通透性轉變抑制劑。同時,采用1,6-二磷酸果糖提高胞內ATP含量后仍不能阻止細胞損傷的發(fā)生,證明了ATP缺失不是引發(fā)低溫損傷的初始誘因。此外,經研究發(fā)現,雙鼠李糖脂在低溫階段通過增加細... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：100 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
第一章 文獻綜述
    1.1 生物人工肝概述
    1.2 肝細胞的低溫保存和超低溫保存
        1.2.1 低溫保存及其保護劑
        1.2.2 低溫損傷機理
        1.2.3 超低溫保存
    1.3 中空纖維型生物人工肝的傳質研究
        1.3.1 反應器傳質特點及其研究現狀
        1.3.2 中空纖維膜擴散系數的獲得方法
        1.3.3 微電極技術及其在傳質檢測中的應用
    1.4 研究思路
第二章 材料與方法
    2.1 動物
    2.2 試劑與器材
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要器材
    2.3 培養(yǎng)基與所用溶液配方
        2.3.1 大鼠肝細胞培養(yǎng)基
        2.3.2 低溫保存培養(yǎng)基
        2.3.3 4×濃縮培養(yǎng)基
        2.3.4 磷酸緩沖液(PBS)
        2.3.5 細胞洗滌培養(yǎng)基
    2.4 大鼠肝細胞收獲方法
    2.5 細胞培養(yǎng)方法
        2.5.1 單層貼壁培養(yǎng)
        2.5.2 中空纖維凝膠包埋培養(yǎng)
        2.5.3 中空纖維柱狀聚集體培養(yǎng)
    2.6 低溫保存方法
    2.7 超低溫保存方法
    2.8 細胞相關功能分析
        2.8.1 細胞活率檢測
        2.8.2 尿素含量分析
        2.8.3 白蛋白分析
        2.8.4 線粒體膜電位檢測
        2.8.5 活性氧自由基檢測
        2.8.6 胞內谷胱甘肽測定
        2.8.7 胞質內游離鈣離子濃度(Ca~(2+))測定
        2.8.8 細胞CYP 450活性測定
        2.8.9 胞內海藻糖濃度測定
        2.8.10 PCR基因檢測
        2.8.11 膠原凝膠收縮率測定
    2.9 中空纖維膜形貌及滲透特性表征
        2.9.1 掃描電極觀察中空纖維膜形貌
        2.9.2 中空纖維膜滲透特性表征
    2.10 傳質相關測定及分析方法
        2.10.1 針形微電極制備
        2.10.2 微電極表面抗污染膜涂布
        2.10.3 平板膜擴散系數測定
        2.10.4 微電極檢測中空纖維膜擴散系數
        2.10.5 微型化透析裝置測定中空纖維膜擴散系數
        2.10.6 微電極測定膠原-細胞混合物的擴散系數
    2.11 統(tǒng)計學處理
第三章 微型化生物人工肝的低溫保存
    3.1 肝細胞培養(yǎng)條件優(yōu)化
    3.2 低溫保存保護劑篩選
    3.3 保護劑合用及其使用方法的優(yōu)化
    3.4 雙鼠李糖脂的作用
    3.5 低溫保存后肝細胞功能的綜合評價
    3.6 低溫保存保護劑用于肝細胞的超低溫保存
        3.6.1 肝細胞的超低溫保存
        3.6.2 單層貼壁培養(yǎng)細胞活性評價
        3.6.3 組織化培養(yǎng)細胞活性評價
    3.7 本章小結
第四章 低溫損傷與保護劑作用機理
    4.1 有效保護劑反映低溫損傷機理
    4.2 苦參堿作用機理
        4.2.1 苦參堿在復溫階段的保護作用
        4.2.2 苦參堿在低溫階段的毒性作用
        4.2.3 苦參堿對胞內游離鈣離子的調節(jié)作用
    4.3 雙鼠李糖脂作用機理
        4.3.1 雙鼠李糖脂單獨作用
        4.3.2 雙鼠李糖脂與海藻糖協(xié)同作用
    4.4 保護劑合用對細胞基因表達的影響
    4.5 保護劑合用對細胞骨架微絲的影響
    4.6 本章小結
第五章 基于微電極的中空纖維膜傳質檢測方法建立
    5.1 微電極檢測物質濃度方法的建立及可行性驗證
        5.1.1 微電極檢測物質濃度方法的建立
        5.1.2 微電極檢測物質濃度隨時間變化的可行性驗證
    5.2 中空纖維膜擴散系數檢測方法的建立
    5.3 微電極檢測中空纖維膜擴散系數的可靠性驗證
        5.3.1 微型透析器法驗證
        5.3.2 不同類型中空纖維膜定性驗證
    5.4 本章小結
第六章 微型化生物人工肝低溫保存保護劑傳質研究
    6.1 微電極表面抗生物污染修飾
        6.1.1 抗污染薄膜制備及其性能評價
        6.1.2 微電極涂布抗污染膜層及其性能評價
    6.2 中空纖維膜及膠原-細胞混合體系中的各種保護劑擴散系數測定
    6.3 低溫保存保護劑在反應器中的傳質達穩(wěn)定所需時間
    6.4 本章小結
第七章 結論與展望
    7.1 總結
    7.2 不足之處
    7.3 展望
論文主要創(chuàng)新點
參考文獻
作者簡歷
攻讀學位期間發(fā)表的論文
發(fā)明專利


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Hepatocyte cryopreservation:Is it time to change the strategy?[J]. Xavier Stéphenne,Mustapha Najimi,Etienne M Sokal.  World Journal of Gastroenterology. 2010(01)
[2]一種用于在體監(jiān)測的新型鈣離子傳感器的研制[J]. 任霞,胡文慧,王穎波,任恕,黃光英,馬長清.  傳感器與微系統(tǒng). 2006(12)
[3]Current status and perspective of liver preservation solutions[J]. Xiao-Ning Feng, Xiao Xu and Shu-Sen Zheng Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China.  Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2006(04)
[4]海藻糖對低溫儲存皮膚β-actin的mRNA轉錄水平及其蛋白表達的影響[J]. 賈曉明,蔡宏,馬彩虹,吳志谷,姚詠明,楊毅,李紹然,陸江陽.  軍醫(yī)進修學院學報. 2006(05)
[5]蒽酮一硫酸法測定酵母中海藻糖的含量[J]. 譚海剛,梅英杰,關鳳梅,王瑞明.  現代食品科技. 2006(01)
[6]傳感器技術在體內藥物分析中的應用概述[J]. 陳勝利,馬長清,鄧定安,任恕.  藥物分析雜志. 2005(09)
[7]Evaluation of diffusion in gel entrapment cell culture within hollow fibers[J]. Dan-Qing Wu, Chong Shen, Qian Zhao, Hui Li, Qin Meng, Department of Chemical Engineering and Biochemical Engineering, Zhejiang University, 38 Zheda Road, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China Gup-Liang Zhang, Institute of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2005(11)
[8]原代乳豬肝細胞低溫保存的初步探索[J]. 劉鴻凌,王英杰,郭海濤,劉國棟,劉俊,于樂成.  肝臟. 2002(03)
[9]微電極及其應用[J]. 潘曉明,劉積靈.  吉林化工學院學報. 2002(01)
[10]無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)乳豬肝細胞的效果[J]. 陳鐘,丁義濤,張鶴云.  世界華人消化雜志. 2002(03)



本文編號：3413877