目的:深入研究聯(lián)合應(yīng)用BMP-2、VEGF和TGF-β殼聚糖納米微球水凝膠緩釋系統(tǒng)體外誘導(dǎo)成骨的時效關(guān)系,以及誘導(dǎo)成骨的效率、質(zhì)量和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。方法:采用離子交聯(lián)法制備負(fù)載BMP-2、VEGF或TGF-β的殼聚糖納米緩釋微球,利用殼聚糖制作溫敏性微孔水凝膠,將負(fù)載生長因子的納米緩釋微球包裹入水凝膠內(nèi),制備出負(fù)載BMP-2、VEGF和TGF-β殼聚糖納米微球水凝膠雙重緩釋系統(tǒng)。體外培養(yǎng)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）,第一階段實(shí)驗(yàn)以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（oeteogenic medium,OM）中添加BMP-2、VEGF和TGF-β的不同組合方式設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組,以單純OM培養(yǎng)基為對照組;第二階段實(shí)驗(yàn)以O(shè)M培養(yǎng)基中添加不同組合的負(fù)載BMP-2、VEGF和TGF-β的殼聚糖納米緩釋系統(tǒng)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組,以單純O M培養(yǎng)基為對照組。使用電鏡、粒度儀及Elisa試劑盒等分析納米微球粒徑,形態(tài),載藥率和釋放曲線等。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的體外增殖能力,成骨效果檢測采用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及其活性定量檢測、茜素紅染色和礦化沉積定量分析4種方法。采用... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

殼聚糖納米微球（A）及殼聚糖納米微球水凝膠（B）制備

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文6圖2使用NanotracwaveII進(jìn)行粒徑分析2.4殼聚糖納米球及殼聚糖納米微球水凝膠緩釋效率測定（1)以包裹BMP-2的殼聚糖納米微球及殼聚糖納米微球水凝膠為例，取12孔板，每組6孔，各加入2.5mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)，37℃水浴振蕩，（2)分別于不同時間(第1、3、6、12、24、48、72h，后每隔3d，觀察終點(diǎn)為第30天)取樣離心(4°C，20000r/min)15min,每次取上清液100μL用ELISA試劑盒檢測BMP-2的量,補(bǔ)充100μLPBS后繼續(xù)振蕩，累積的釋藥率按公式③計(jì)算：累積釋藥率=/M×100%③（其中V0是釋放介質(zhì)的去除體積，Ci是在不同時間收集的釋放的BMP-2的濃度，M是樣品的總BMP-2）（3)根據(jù)上述結(jié)果繪制殼聚糖納米微球及殼聚糖納米微球水凝膠中BMP-2的釋放曲線。3細(xì)胞培養(yǎng)（1）第一階段實(shí)驗(yàn)：采用DMEM（高糖型）添加10％FBS和1％雙抗（青霉素/鏈霉素）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2，100%濕度）培養(yǎng)細(xì)胞MC3T3-E1。在上述培養(yǎng)基中添加10mMβ-甘油磷酸酯，50ug/mL抗壞血酸和10-7mM地塞米松構(gòu)建成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中單獨(dú)或組合添加BMP-2（10ng/mL），VEGF（10ng/mL）和/或TGF-β1（5ng/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，分組如表1所示分

結(jié)果11結(jié)果1殼聚糖納米微球水凝膠緩釋系統(tǒng)1.1殼聚糖納米微球粒徑分析負(fù)載BMP-2的殼聚糖納米微球平均粒徑為197±7.1nm，PDI為0.21，Zeta電位為+35.42mV。圖3殼聚糖納米微球粒徑分布1.2殼聚糖納米微球載藥率及包封率通過Elisa試劑盒檢測上清液及離心沉淀洗滌液中BMP-2剩余量，負(fù)載BMP-2的殼聚糖納米微球的BMP-2包封率為70.24±4.05％，載藥率為59.84±3.06％。1.3殼聚糖納米微球及殼聚糖納米微球水凝膠緩釋系統(tǒng)體外釋放曲線通過Elisa試劑盒檢測上清液BMP-2含量變化繪制殼聚糖納米微球及殼聚糖納米微球水凝膠緩釋系統(tǒng)體外釋藥緩釋曲線（圖4），負(fù)載BMP-2殼聚糖納米微球前48h的累積釋放率為53.78±2.29％，而負(fù)載BMP-2殼聚糖納米微球水凝膠緩釋系統(tǒng)前48h的累積釋放率為34.78±3.42％。負(fù)載BMP-2殼聚糖納米微球的累積釋放率在第9天為74.58±5.30％，在第18天為81.67±4.33％，在第30天為86.20±4.87％。負(fù)載BMP-2殼聚糖納米微球水凝膠緩釋系統(tǒng)在第9天的累積釋放率為60.71±3.60％，第18天的累積釋放率為70.46±3.30％，第30天的累積釋放率為78.05±3.22％。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]控釋重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和血管內(nèi)皮生長因子的微囊支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響[J]. 任前貴,張坤,任威,孫韜,李永峰,馬麗波.  中國生物制品學(xué)雜志. 2019(12)
[2]Bone-conditioned medium contributes to initiation and progression of osteogenesis by exhibiting synergistic TGF-β1/BMP-2 activity[J]. Maria B.Asparuhova,Jordi Caballé-Serrano,Daniel Buser,Vivianne Chappuis.  International Journal of Oral Science. 2018(04)
[3]3D仿生打印組織工程骨修復(fù)下頜骨缺損[J]. 杜國慶,孫健,李亞莉,陳立強(qiáng),陳晨,鄧楠,吳雨桐,李莉,王志浩.  中國組織工程研究. 2018(18)
[4]骨形成蛋白-2與其他生長因子聯(lián)合應(yīng)用對骨再生的影響[J]. 商玲玲,葛少華.  口腔醫(yī)學(xué). 2017(11)
[5]3D生物打印構(gòu)建聚乳酸羥基乙酸/納米羥基磷灰石支架骨形態(tài)發(fā)生蛋白2緩釋復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 臧曉龍,孫健,李亞莉,陳立強(qiáng),楊學(xué)財(cái),梁立卿,杜國慶.  中國組織工程研究. 2016(16)
[6]骨形態(tài)發(fā)生蛋白2殼聚糖納米緩釋載體的制備及性能測定[J]. 劉峰,孫健,李亞莉,陳立強(qiáng),解京森,臧曉龍.  上海口腔醫(yī)學(xué). 2015(02)
[7]TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Md Shaifur Rahman,Naznin Akhtar,Hossen Mohammad Jamil,Rajat Suvra Banik,Sikder M Asaduzzaman.  Bone Research. 2015(01)
[8]Notch信號通路對VEGF促大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用[J]. 廖鳳玲,陳日玲,姜杉,田川.  中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志. 2014(04)
[9]生長因子緩釋系統(tǒng)復(fù)合納米支架材料修復(fù)犬下頜骨缺損[J]. 周慶梅,孫健,李亞莉,陳立強(qiáng),許堯祥.  中國組織工程研究. 2013(21)
[10]血管內(nèi)皮生長因子對骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響及其信號機(jī)制[J]. 張俊,謝珊珊,韓曉霞,任金濤,呂富冉,唐俊明,鄭飛,郭凌鄖,楊建業(yè),孔霞,張蕾,黃永章,王家寧.  南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2011(10)

博士論文
[1]ATRA調(diào)控BMP9誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成骨和成脂分化的作用及機(jī)制研究[D]. 劉洋.重慶醫(yī)科大學(xué) 2014

碩士論文
[1]BMP2誘導(dǎo)人根尖乳頭干細(xì)胞分化的作用及機(jī)制的研究[D]. 路亞婷.山東大學(xué) 2016



本文編號：3353822