本文關(guān)鍵詞：hEGF生物活性新型蠶材料的創(chuàng)制與研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蠶絲作為一種紡織材料,因光澤柔和、吸濕保暖性好、易于加工、舒適度好且能通過印染輕松染色等優(yōu)點(diǎn)在服裝紡織行業(yè)享有美譽(yù)。同時(shí),蠶絲作為一種理想的生物材料,因獨(dú)特的機(jī)械性能、良好的生物相容性、較強(qiáng)的環(huán)境穩(wěn)定性和可緩慢降解等特性,逐漸在醫(yī)學(xué)和生物組織工程領(lǐng)域嶄露頭角。然而,天然蠶絲仍舊存在染色牢固度差、易脫色、機(jī)械性能遠(yuǎn)不及蜘蛛絲纖維、其醫(yī)學(xué)材料特性依舊滿足不了當(dāng)前醫(yī)學(xué)組織工程研究需要等缺陷。為了改善天然蠶絲存在的上述缺陷,研究人員們建立了基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶絲腺特異啟動(dòng)系統(tǒng),探索利用轉(zhuǎn)基因家蠶創(chuàng)造具有新型功能蠶絲材料的可行性,例如通過在家蠶絲腺表達(dá)熒光蛋白,獲得在自然光下即可呈現(xiàn)綠色、紅色或橘色的轉(zhuǎn)基因彩色蠶絲；通過在絲腺表達(dá)外源蜘蛛絲蛋白或多肽,獲得機(jī)械性能增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因蠶絲；通過絲腺表達(dá)不同醫(yī)用目的的外源蛋白和多肽,獲得細(xì)胞粘連性、生物相容性或鈣離子吸附能力提高的具有特定新功能的轉(zhuǎn)基因醫(yī)學(xué)蠶絲材料。但是,利用上述方法獲得的蠶絲材料仍有不足,轉(zhuǎn)基因彩色蠶絲出現(xiàn)了機(jī)械性能的下降,轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因獲得的蠶絲機(jī)械性能增強(qiáng)不顯著,醫(yī)用蠶絲材料中表達(dá)的目的蛋白不具有生物學(xué)活性等。人表皮生長(zhǎng)因子(human epidermal growth factor, hEGF)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一類多肽物質(zhì),能極強(qiáng)的促進(jìn)各種表皮細(xì)胞的生長(zhǎng),在醫(yī)學(xué)上用于燒燙傷、潰瘍、各類創(chuàng)傷以及角膜損傷的治療。為了探究能否利用家蠶絲腺特異啟動(dòng)系統(tǒng)表達(dá)出具有生物學(xué)活性的hEGF,從而獲得具有hEGF生物學(xué)活性的蠶絲材料。我們基于本研究團(tuán)隊(duì)2010年獲得的絲素重鏈高效表達(dá)載體R3,構(gòu)建了兩個(gè)不同絲腺特異表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)基因擬期創(chuàng)制具有hEGF生物活性新型蠶絲材料。具體研究?jī)?nèi)容如下：1、兩種hEGF-重鏈融合蛋白轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建家蠶絲素重鏈表達(dá)載體R3,主要由絲素重鏈基因N端、C端序列以及中間融合表達(dá)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因構(gòu)成,在表達(dá)載體R3的基礎(chǔ)上,我們用hEGF基因?qū)GFP基因替換,構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac{Fib-H P3-hEGF-LBS;3×P3-DsRed};在hEGF-重鏈融合蛋白能夠正常加工和分泌的前提下,將信號(hào)肽切割位點(diǎn)(Cs)下游的重鏈N端序列以及參與蛋白分泌的半胱氨酸(Cys)上游的重鏈C端序列盡數(shù)截去,構(gòu)建了另一個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac{Fib-H P3(s)-hEGF-LBS(s); 3×P3-DsRed}。2、hEGF轉(zhuǎn)基因品系的建立和分子鑒定通過家蠶顯微注射的方法,將hEGF-重鏈融合蛋白轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體和輔助質(zhì)粒pHA3PIG共同導(dǎo)入家蠶實(shí)用品種871非滯育的GO代早期胚胎中,并利用體式熒光顯微鏡對(duì)回交產(chǎn)生的G1代蠶卵胚胎和蠶蛾眼部進(jìn)行紅色熒光的篩選。將載體pBac{Fib-H P3-hEGF-LBS; 3×P3-DsRed}注射獲得的轉(zhuǎn)基因系命名為TSL-P;將載體pBac{Fib-HP3(s)-hEGF-LBS(s);3×P3-DsRed}注射獲得的轉(zhuǎn)基因系命名為TSL-P(s)。其中TSL-P陽(yáng)性率為11/60(18.3%),TSL-P(s)陽(yáng)性率為7/31(22.6%)。通過Southern blotting和Inverse PCR對(duì)TSL-P和TSL-P(s)共18個(gè)陽(yáng)性品系個(gè)體的外源基因片段插入拷貝數(shù)和位置進(jìn)行統(tǒng)計(jì),其中轉(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF純蛋白含量最高的TSL-P-2和TSL-P(s)-7兩個(gè)品系都是單拷貝,分別插入在家蠶9號(hào)和8號(hào)染色體上。3、轉(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF-重鏈融合蛋白的分子檢測(cè)利用0.6g mL-1 LiSCN溶液溶解蠶繭、離心取上清獲得蠶絲蛋白樣品,并通過SDS-PAGE和Western blotting對(duì)蠶絲蛋白樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明：1、hEGF-重鏈融合蛋白均已在TSL-P和TSL-P(s)轉(zhuǎn)基因家蠶后部絲腺表達(dá)并參與蠶繭的形成,并且TSL-P轉(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF蛋白含量的平均值(4.9%)遠(yuǎn)大于TSL-P(s)(2.1%),其中TSL-P-2和TSL-P(s)-7 hEGF純蛋白的含量最高,分別為16.7%和3.0%；2、hEGF-重鏈融合蛋白的實(shí)際分子質(zhì)量,TSL-P大于預(yù)測(cè)值,而TSL-P(s)與預(yù)測(cè)值大小一致,該結(jié)果表明TSL-P轉(zhuǎn)基因系融合蛋白可能存在磷酸化、甲基化等后期加工修飾過程,結(jié)合之前研究結(jié)果可以推斷出后期加工修飾的區(qū)域就是位于本研究中被截去的絲素重鏈C段序列。4、轉(zhuǎn)基因蠶絲中hEGF生物學(xué)活性檢測(cè)利用55℃堿液對(duì)轉(zhuǎn)基因蠶絲材料進(jìn)行脫膠處理,并對(duì)脫膠后的蠶絲材料是否具有hEGF生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)。將浸泡過脫膠蠶絲的細(xì)胞培養(yǎng)基用于人表皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng),通過Brdu免疫熒光對(duì)細(xì)胞分裂率進(jìn)行分析；將相同質(zhì)量和體積的脫膠繭片鋪在人表皮成纖維細(xì)胞表面進(jìn)行共培養(yǎng),5天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行MTT增值分析。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明,TSL-P(s)轉(zhuǎn)基因蠶絲中的融合蛋白具有hEGF的生物學(xué)活性,可以促進(jìn)人表皮成纖維細(xì)胞的分裂和增殖,而TSL-P轉(zhuǎn)基因系蠶繭中的融合蛋白幾乎沒有生物學(xué)活性。本研究利用家蠶絲素重鏈表達(dá)載體成功在蠶絲中表達(dá)了hEGF-重鏈融合蛋白,獲得一種具有hEGF生物學(xué)活性的轉(zhuǎn)基因蠶絲材料。該研究結(jié)果可以為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶新型生物材料創(chuàng)制方面的應(yīng)用以及轉(zhuǎn)基因蠶絲作為醫(yī)用材料的前景提供了一定的理論和應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：蠶絲生物材料 人表皮生長(zhǎng)因子 絲素重鏈表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)基因家蠶
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08;Q78
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-30
• 1.1 概述14-16
• 1.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展16-24
• 1.2.1 PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)16-18
• 1.2.2 新型基因編輯技術(shù)18-24
• 1.3 繭絲素材創(chuàng)新研究進(jìn)展24-28
• 1.3.1 絲膠融合表達(dá)載體的素材創(chuàng)新24-25
• 1.3.2 絲素融合表達(dá)載體的素材創(chuàng)新25-28
• 1.4 人類表皮生長(zhǎng)因子研究進(jìn)展28-30
• 第二章 引言30-32
• 2.1 研究背景與意義30
• 2.2 主要研究?jī)?nèi)容30-31
• 2.3 技術(shù)路線31-32
• 第三章 hEGF-重鏈融合蛋白轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建32-40
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑32-33
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料32
• 3.1.2 主要儀器和試劑32-33
• 3.1.3 主要溶液及其配置33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法33-36
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)33
• 3.2.2 目的片段的克隆33-36
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建36
• 3.3 結(jié)果與分析36-38
• 3.3.1 hEGF基因片段的合成36-37
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建37-38
• 3.3.3 重鏈融合蛋白氨基酸序列比較38
• 3.4 小結(jié)與討論38-40
• 第四章 hEGF轉(zhuǎn)基因品系的建立和分子鑒定40-52
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑40-41
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 4.1.2 主要儀器和試劑40
• 4.1.3 主要溶液及其配置40-41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-47
• 4.2.1 轉(zhuǎn)基因載體的顯微注射41-42
• 4.2.2 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體家蠶的篩選與飼養(yǎng)42
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體的分子鑒定42-47
• 4.3 結(jié)果與分析47-50
• 4.3.1 顯微注射及轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體的篩選統(tǒng)計(jì)47-48
• 4.3.2 外源基因片段插入拷貝數(shù)分析48-49
• 4.3.3 外源基因片段插入位點(diǎn)分析49-50
• 4.4 小結(jié)與討論50-52
• 第五章 轉(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF-重鏈融合蛋白的分子檢測(cè)52-58
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑52-53
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料52
• 5.1.2 主要儀器和試劑52
• 5.1.3 主要溶液及其配置52-53
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 5.2.1 蠶絲總蛋白樣品制備53
• 5.2.2 SDS-PAGE蛋白電泳53-54
• 5.2.3 Western blotting檢測(cè)54
• 5.2.4 hEGF純蛋白含量計(jì)算54
• 5.3 結(jié)果與分析54-56
• 5.3.1 hEGF-重鏈融合蛋白的分子檢測(cè)54-56
• 5.4 小結(jié)與討論56-58
• 第六章 轉(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF-重鏈融合蛋白生物學(xué)活性檢測(cè)58-64
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑58-59
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料58
• 6.1.2 主要儀器和試劑58
• 6.1.3 主要溶液及其配置58-59
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法59-60
• 6.2.1 脫膠繭絲的制備59
• 6.2.2 脫膠繭片的制備59
• 6.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代59
• 6.2.4 Brdu免疫熒光分析59-60
• 6.2.5 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)60
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-63
• 6.3.1 Brdu免疫熒光結(jié)果與分析60-62
• 6.3.2 MTT細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析62-63
• 6.4 小結(jié)與討論63-64
• 第七章 總結(jié)64-66
• 參考文獻(xiàn)66-76
• 附錄76-78
• 在校期間發(fā)表的文章及科研情況78-80
• 致謝80-81

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳華,朱良均,閔思佳,胡國(guó)梁;蠶絲絲膠蛋白的結(jié)構(gòu)、性能及利用[J];功能高分子學(xué)報(bào);2001年03期

  本文關(guān)鍵詞：hEGF生物活性新型蠶材料的創(chuàng)制與研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：335073