本文關(guān)鍵詞：金納米顆粒標(biāo)記呼吸道合胞病毒入侵細(xì)胞的實時暗場光散射成像分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：病毒,尤其是傳染性病毒,對人類身體健康具有很大危害。因此,了解和闡明病毒入侵宿主細(xì)胞的過程和機制對預(yù)防和治療病毒性疾病十分重要。目前,研究病毒入侵細(xì)胞過程常采用單個病毒視蹤技術(shù),即通過觀察單個病毒入侵宿主細(xì)胞的實時動態(tài)過程來闡釋病毒入侵宿主細(xì)胞的機制。近年來,為成功示蹤病毒,人們常利用熒光蛋白分子或熒光染料對病毒和細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記,但存在著熒光強度低、易光漂白等缺點,難于長時間示蹤單個病毒。熒光量子點可以避免上述缺點,但其生物相容性和穩(wěn)定性有待提高。因此如何避免標(biāo)記材料自身的不足是一個值得研究的問題。本文利用生物相容性好的金納米顆粒標(biāo)記呼吸道合胞病毒(RSV),實現(xiàn)對單個病毒侵染宿主細(xì)胞過程的長時間實時成像,有利于進(jìn)一步了解呼吸道合胞病毒侵染機制。具體的研究內(nèi)容包括以下三個方面：1.選擇性定量細(xì)胞膜表面吸附的呼吸道合胞病毒。利用RSV多克隆抗體修飾的金納米顆粒靶向標(biāo)記病毒,并以宿主細(xì)胞作為檢測病毒的基底,通過統(tǒng)計靶向于細(xì)胞膜表面病毒所在位置的金納米顆粒的散射信號的百分比,實現(xiàn)可視化定量細(xì)胞膜表面的病毒。當(dāng)將一定量的病毒加入細(xì)胞基底并洗棄未侵染細(xì)胞的多余病毒后,再加入RSV多克隆抗體修飾的金納米顆粒反應(yīng)一段時間,讓金納米顆粒靶向結(jié)合到細(xì)胞表面的病毒,在暗場下成像觀察發(fā)現(xiàn),隨著所加病毒量增加,細(xì)胞表面金納米顆粒的散射信號逐漸增強。將所得成像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)病毒的量和細(xì)胞膜表面金納米顆粒散射信號的百分比呈函數(shù)增長。此實驗以細(xì)胞作為病毒檢測基底,金納米顆粒散射信號作為檢測病毒量的信號,實現(xiàn)了可視化定量具有感染能力的病毒。由此,對具有侵染能力的病毒建立了一種選擇性強,靈敏度高,操作簡單的可視化分析方法。2.金納米顆粒標(biāo)記病毒侵染細(xì)胞的過程實時監(jiān)控。利用鏈霉親和素(SA)修飾的金納米顆粒對病毒進(jìn)行標(biāo)記,在暗場下通過觀察金納米顆粒修飾的病毒的散射信號,實現(xiàn)長時間實時觀察病毒侵染細(xì)胞的過程。SA是一種含有巰基的蛋白,可以通過金硫鍵修飾到金納米顆粒表面。另外通過對病毒表面的膜蛋白進(jìn)行生物素(Biotin)標(biāo)記制得生物素標(biāo)記病毒。由于一分子SA可以和四分子生物素高度特異性結(jié)合,故SA修飾的金納米顆粒能用于標(biāo)記生物素化的病毒。金納米顆粒具有獨特的局域表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)性質(zhì),因此通過在暗場顯微鏡下觀察金納米顆粒修飾病毒的散射信號就可長時間實時觀察病毒入侵細(xì)胞的過程。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),病毒入侵細(xì)胞的過程快速、短暫,大約1分鐘左右的時間,且病毒入侵細(xì)胞可能是一個胞吞的過程。與其他熒光信號標(biāo)記病毒方法相比,金納米顆粒生物相容性好,穩(wěn)定性好,不存在信號強度低和易光漂白的問題,并且這種標(biāo)記策略簡單、溫和、對病毒感染力影響較小。3.熒光和散射雙模式成像呼吸道合胞病毒的核酸。本實驗將金納米顆粒作為能量供受體和發(fā)光元件,發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA作為病毒核酸RNA分子檢測元件,實現(xiàn)了病毒侵入細(xì)胞后,病毒核酸RNA復(fù)制過程的熒光和暗場雙模式成像。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA通過5’端的巰基偶聯(lián)至金納米顆粒表面,導(dǎo)致其3’端四甲基羅丹明(TAMRA)的熒光淬滅,金納米顆粒的散射信號減弱呈暗綠色。在堿基互補配對作用下,發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部閉合。當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的環(huán)部與病毒核酸RNA雜交,金納米顆粒上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,TAMRA熒光恢復(fù),金納米顆粒散射信號增強呈亮綠色。從而實現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)病毒核酸RNA熒光和暗場雙模式成像。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),病毒侵入細(xì)胞后,在細(xì)胞膜附近區(qū)域進(jìn)行大量核酸復(fù)制。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA修飾的金納米顆粒探針制備簡單,且將熒光成像和暗場成像成功的結(jié)合,可能被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域。綜上所述,本文利用金納米顆粒實現(xiàn)了對RSV簡單快速標(biāo)記,利用金納米顆粒的散射信號,借助于暗場光散射成像技術(shù),成功實現(xiàn)長時間示蹤病毒侵染細(xì)胞過程。本文在保證病毒自身感染力的情況下實現(xiàn)了對病毒的簡單快速標(biāo)記。選用金納米顆粒作為標(biāo)記材料避免了熒光染料和熒光蛋白的熒光信號弱、易光漂白及量子點生物相容性低、穩(wěn)定性不好等缺點。本文也實現(xiàn)了對細(xì)胞膜表面病毒的定量檢測、病毒入侵細(xì)胞過程及病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制RNA核酸過程的成像。論文對病毒侵染細(xì)胞過程由外到內(nèi)一一進(jìn)行成像分析,這對深入了解病毒侵染細(xì)胞機制提供了條件。此外,本文采用金納米顆粒散射信號進(jìn)行成像分析的策略,有望拓展至將其它生物相容性好的納米材料用于生物標(biāo)記應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域。
【關(guān)鍵詞】：金納米顆粒 病毒 局域表面等離子共振 暗場散射成像
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318;TB383.1
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第1章 論文選題依據(jù)及研究內(nèi)容12-26
• 1.1 論文選題依據(jù)12-24
• 1.1.1 研究意義12-13
• 1.1.2 研究現(xiàn)狀13-24
• 1.2 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題24-25
• 1.2.1 研究目標(biāo)24
• 1.2.2 研究內(nèi)容24-25
• 1.2.3 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題25
• 1.3 技術(shù)路線25-26
• 第2章 選擇性定量細(xì)胞表面吸附的呼吸道合胞病毒26-34
• 2.1 前言26
• 2.2 實驗部分26-29
• 2.2.1 實驗儀器26-27
• 2.2.2 試劑27
• 2.2.3 AuNPs的合成27-28
• 2.2.4 AuNPs的修飾28
• 2.2.5 HEp-2細(xì)胞復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)28
• 2.2.6 RSV擴增28-29
• 2.2.7 暗場光散射成像29
• 2.3 結(jié)果與討論29-33
• 2.3.1 AuNPs的修飾與表征29-30
• 2.3.2 AuNPs標(biāo)記病毒暗場成像30-31
• 2.3.3 不同濃度病毒侵染細(xì)胞成像31-32
• 2.3.4 暗場成像定量RSV的線性曲線32-33
• 2.4 小結(jié)33-34
• 第3章 金納米顆粒標(biāo)記病毒侵染細(xì)胞的過程實時監(jiān)控34-46
• 3.1 前言34-35
• 3.2 實驗部分35-39
• 3.2.1 實驗儀器35
• 3.2.2 試劑35-36
• 3.2.3 HEp-2細(xì)胞培養(yǎng)36
• 3.2.4 RSV的擴增36
• 3.2.5 病毒生物素化修飾36
• 3.2.6 AuNPs的合成36-37
• 3.2.7 AuNPs的修飾37
• 3.2.8 AuNPs生物相容性測定37
• 3.2.9 標(biāo)記病毒滴度分析37-38
• 3.2.10 生物素標(biāo)記病毒感染力的測定38
• 3.2.11 熒光共聚焦成像38
• 3.2.12 免疫熒光分析38
• 3.2.13 AuNPs標(biāo)記病毒暗場成像38
• 3.2.14 AuNPs標(biāo)記病毒侵染細(xì)胞過程的實時暗場成像38-39
• 3.3 結(jié)果與討論39-45
• 3.3.1 AuNPs的修飾與表征39-40
• 3.3.2 AuNPs標(biāo)記病毒表征40-41
• 3.3.3 AuNPs標(biāo)記病毒感染力測定41-42
• 3.3.4 AuNPs標(biāo)記病毒侵染細(xì)胞暗場成像42-44
• 3.3.5 實時暗場光散射成像44-45
• 3.4 小結(jié)45-46
• 第4章 熒光和散射雙模式成像呼吸道合胞病毒的核酸46-52
• 4.1 前言46-47
• 4.2 實驗部分47-49
• 4.2.1 實驗儀器47-48
• 4.2.2 試劑48
• 4.2.3 HEp-2細(xì)胞培養(yǎng)48
• 4.2.4 RSV的擴增48
• 4.2.5 AuNPs合成48
• 4.2.6 AuNPs修飾上特定DNA系列48-49
• 4.2.7 DNA修飾AuNPs與靶物DNA雜交49
• 4.2.8 DNA修飾AuNPs用于病毒核酸熒光成像49
• 4.3 結(jié)果與討論49-51
• 4.3.1 DNA修飾AuNPs表征49-50
• 4.3.2 DNA修飾AuNPs進(jìn)行病毒核酸熒光成像50
• 4.3.3 DNA修飾AuNPs進(jìn)行病毒核酸暗場散射成像50-51
• 4.4 小結(jié)51-52
• 第5章 全文總結(jié)與展望52-56
• 5.1 全文總結(jié)52-53
• 5.2 論文創(chuàng)新點53-54
• 5.3 前景展望54-56
• 5.3.1 顆粒大小均勻的AuNPs的開發(fā)54
• 5.3.2 其它生物相容性好的納米材料的開發(fā)54
• 5.3.3 病毒暗場共定位成像應(yīng)用54-56
• 參考文獻(xiàn)56-68
• 科研成果68-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ZOU BoZhou;LIU Yue;YAN XiaoLi;HUANG ChengZhi;;Gold nanoparticles based digital color analysis for quinidine detection[J];Chinese Science Bulletin;2013年17期

  本文關(guān)鍵詞：金納米顆粒標(biāo)記呼吸道合胞病毒入侵細(xì)胞的實時暗場光散射成像分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：334197