本文關(guān)鍵詞：VEGF165基因修飾的hADSCs與改性絲素蛋白支架材料構(gòu)建血管化組織工程脂肪的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：探討VEGF165基因修飾的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)與改性絲素蛋白支架材料構(gòu)建血管化組織工程脂肪的可行性。方法：1.分離、培養(yǎng)及鑒定人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs),選擇生長(zhǎng)良好的P3 hADSCs,接種于殼聚糖修飾的絲素蛋白支架材料(CS/SF),MTT法檢測(cè)細(xì)胞在CS/SF上的粘附和增殖能力。成脂誘導(dǎo)14天后電鏡及光鏡分別觀(guān)察細(xì)胞在支架材料上的粘附和生長(zhǎng),以評(píng)估支架材料與hADSCs的生物相容性。2.攜帶重組人VEGF165基因的慢病毒感染P3 hADSCs,將細(xì)胞與支架材料體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分三步,第一步：將P3 hADSCs(對(duì)照組C1)及慢病毒感染(MOI=50)的P3 hADSCs(實(shí)驗(yàn)組E1)分別行成脂誘導(dǎo),14天后行油紅0染色,檢測(cè)慢病毒感染對(duì)hADSCs成脂能力的影響。第二步：將P3 hADSCs(對(duì)照組C2)與慢病毒感染的P3 hADSCs(實(shí)驗(yàn)組E2)分別接種于支架材料上,MTT法評(píng)估慢病毒感染后,對(duì)hADSCs在支架材料上增殖能力的影響；第三步：C2組及E2組細(xì)胞-支架復(fù)合物體外成脂誘導(dǎo),分別作為對(duì)照組C3及實(shí)驗(yàn)組E3,14天后,采用RT-PCR檢測(cè)成脂特異性基因PPARγ-2并行油紅0染色,評(píng)估慢病毒感染對(duì)hADSCs在支架材料上成脂能力的影響。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。取24只雌性Wistar大鼠,每組12只。將上述C3、E3兩組細(xì)胞—支架復(fù)合物體外成脂誘導(dǎo)5天后分別移植入大鼠背部皮下,移植后8周、12周分別取材并觀(guān)察移植物,同時(shí)觀(guān)察支架材料的降解情況,移植物行冰凍切片、HE染色、油紅0染色及掃描電鏡觀(guān)察。Western Blot檢測(cè)VEGF165及PPARγ-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.hADSCs接種于支架材料后,在支架材料上粘附、增殖良好。成脂誘導(dǎo)14天后,油紅0染色表明殼聚糖修飾的絲素蛋白支架材料上有大量脂肪細(xì)胞生成,掃描電鏡下亦可見(jiàn)成熟脂肪細(xì)胞生成。2.感染72h后,熒光顯微鏡下即可見(jiàn)El組hADSCs呈現(xiàn)微弱的綠色熒光,96h后熒光明顯增強(qiáng)。成脂誘導(dǎo)14天后,E1組和C1組均可見(jiàn)大量成熟脂肪細(xì)胞,兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),慢病毒感染對(duì)hADSCs成脂能力無(wú)影響；MTT試驗(yàn)表明,慢病毒感染后,實(shí)驗(yàn)組E2和對(duì)照組C2細(xì)胞支架材料上增殖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；油紅0染色及RT-PCR均表明：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞—支架復(fù)合物體外成脂誘導(dǎo)后,均可見(jiàn)大量成熟脂肪細(xì)胞生成,兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：植入體內(nèi)8周及12周后,Western Blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組移植物均表達(dá)VEGF165,對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均表達(dá)PPARγ-2,實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量明顯多于對(duì)照組(P0.05)。掃描電鏡、油紅0染色及HE染色均表明實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均生成大量脂肪樣細(xì)胞,且實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論1.CS/SF支架材料具有良好的生物相容性,hADSCs在CS/SF支架材料上粘附、增殖良好。2.攜帶重組人VEGF165基因的慢病毒感染hADSCs后,接種于支架材料,在體外能成功構(gòu)建組織化工程脂肪。3.攜帶重組人VEGF165基因的慢病毒感染的hADSCs與CS/SF支架材料復(fù)合物在大鼠體內(nèi)可持續(xù)表達(dá)VEGF165及PPARγ-2蛋白,能顯著促進(jìn)工程化脂肪組織的構(gòu)建,為構(gòu)建血管化組織工程脂肪奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：血管化組織工程脂肪 VEGF165 殼聚糖修飾的絲素蛋白支架材料 慢病毒
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-12
• 前言12-14
• 第一部分 殼聚糖修飾的絲素蛋白支架材料與hADSCs生物相容性的研究14-19
• 1 材料和方法14-16
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 主要試劑和儀器14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-16
• 1.2.1 hADSCs的分離、培養(yǎng)15
• 1.2.2 hADSCs的鑒定15
• 1.2.3 改性絲素蛋白支架材料的處理及電鏡觀(guān)察15-16
• 1.2.4 MTT法檢測(cè)hADSCs在CS/SF上的粘附與增殖16
• 1.2.5 hADSCs-CS/SF成脂誘導(dǎo)后光鏡、電鏡觀(guān)察16
• 2 數(shù)據(jù)處理16
• 3 結(jié)果16-18
• 3.1 hADSCs的分離及培養(yǎng)16-17
• 3.2 hADSCs的鑒定17
• 3.3 CS/SF支架的掃描電鏡觀(guān)察17
• 3.4 MTT法檢測(cè)hADSCs在CS/SF上的粘附與增殖17
• 3.5 hADSCs-CS/SF成脂誘導(dǎo)在CS/SF支架上的生長(zhǎng)狀況及掃描電鏡觀(guān)察17-18
• 4 討論18-19
• 第二部分 VEGF165基因修飾的hADSCs與改性絲素蛋白支架材料體外構(gòu)建組織工程脂肪的研究19-25
• 1 材料和方法19-21
• 1.1 材料19-20
• 1.1.1 主要試劑和儀器19-20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-21
• 1.2.1 hADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定20
• 1.2.2 慢病毒感染hADSCs20
• 1.2.3 慢病毒感染hADSCs后成脂誘導(dǎo)20
• 1.2.4 MTT法檢測(cè)慢病毒感染后hADSCs在支架材料上的增殖20
• 1.2.5 慢病毒感染的hADSCs在支架材料上成脂誘導(dǎo)20-21
• 1.2.6 RT-PCR檢測(cè)成脂特異性基因PPARγ-2的表達(dá)21
• 2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析21
• 3 結(jié)果21-23
• 3.1 慢病毒感染hADSCs21-22
• 3.2 慢病毒感染hADSCs后成脂誘導(dǎo)22
• 3.2.1 倒置顯微鏡觀(guān)察22
• 3.2.2 油紅O染色22
• 3.3 MTT法檢測(cè)慢病毒感染的hADSCs在支架材料上的增殖22
• 3.4 慢病毒感染的hADSCs在支架材料上成脂誘導(dǎo)22-23
• 3.4.1 油紅O染色22
• 3.4.2 RT-PCR22-23
• 4 討論23-25
• 第三部分 VEGF165基因修飾的hADSCs與改性絲素蛋白體內(nèi)構(gòu)建血管化組織工程脂肪的研究25-31
• 1 材料和方法25-27
• 1.1 材料25-26
• 1.1.1 主要試劑和儀器25-26
• 1.2 方法26-27
• 1.2.1 hADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定26
• 1.2.2 慢病毒感染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞26
• 1.2.3 支架材料的處理26
• 1.2.4 細(xì)胞與支架材料的復(fù)合培養(yǎng)及成脂誘導(dǎo)26
• 1.2.5 CM-DIL標(biāo)記細(xì)胞26
• 1.2.6 細(xì)胞-支架材料復(fù)合物移植26
• 1.2.7 移植物觀(guān)察26-27
• 1.2.8 免疫印跡法檢測(cè)VEGF165、PPARγ-2蛋白27
• 2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27
• 3 結(jié)果27-29
• 3.1 CM-DIL標(biāo)記的細(xì)胞-支架復(fù)合物27
• 3.2 移植物大體觀(guān)察27-28
• 3.3 移植物組織學(xué)觀(guān)察28
• 3.3.1 熒光顯微鏡下觀(guān)察28
• 3.3.2 油紅O-HE染色28
• 3.3.3 HE染色28
• 3.3.4 掃描電鏡28
• 3.4 移植物中VEGF165、PPAR γ-2蛋白的表達(dá)28-29
• 4 討論29-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 綜述35-41
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 在學(xué)期間的研究成果41-42
• 致謝42-43
• 附圖43-52

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 陶忠芬,蔡永國(guó),楊仕明,可金星,黃文琪,肖桃元,房殿春;樹(shù)突狀細(xì)胞掃描電鏡樣本制備方法[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年12期

2 劉毅;肖宏濤;薛美思;;適宜于構(gòu)建組織工程化脂肪的蠶絲蛋白支架:最佳孔徑篩選[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年08期

3 徐紅珍;蘇儉生;;組織工程骨的血管化研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年04期

4 劉毅;唐軍;李世龍;;基因轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與絲素蛋白構(gòu)建組織工程脂肪[J];中國(guó)組織工程研究;2013年14期

  本文關(guān)鍵詞：VEGF165基因修飾的hADSCs與改性絲素蛋白支架材料構(gòu)建血管化組織工程脂肪的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：329591