發(fā)布時(shí)間：2017-04-26 14:07

  本文關(guān)鍵詞：碳離子硅橡膠改性材料的表面性能及其細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的 在整形外科領(lǐng)域，主要依靠植入軟組織填充材料來(lái)修復(fù)體表組織器官的畸形或缺損。硅橡膠（Silicone rubber，SR）因其具有良好的理化穩(wěn)定性及加工性能，目前仍是臨床上最常用的軟組織填充材料。但SR材料表面呈現(xiàn)強(qiáng)烈的疏水性，使其與人體組織親和力較差，可導(dǎo)致一系列臨床副反應(yīng)。因此，選擇合適的改性處理方式對(duì)硅橡膠材料進(jìn)行改性，不僅可以提高其臨床治療效果，而且對(duì)于研究細(xì)胞生物學(xué)行為與材料學(xué)特性之間的關(guān)系都有著意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在對(duì)硅橡膠進(jìn)行表面改性的研究方法中，有接枝共聚、仿生涂層等方法，但因均存在一些問(wèn)題，限制了硅橡膠的表面改性效果。如：接枝共聚法，是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在聚合物活化的基礎(chǔ)上引入特定化學(xué)基團(tuán)，整個(gè)過(guò)程不僅步驟繁瑣，而且形成的化學(xué)基團(tuán)不穩(wěn)定等因素影響了其改性效果；仿生涂層法，是通過(guò)噴涂、濺射等方法，在保持材料本身特性的基礎(chǔ)上，覆上一層生物活性物質(zhì)在材料表面，這種改性方法也存在步驟較為繁瑣、難控制操作條件等問(wèn)題，限制了它的推廣應(yīng)用。 于是，我們?cè)谇捌诠ぷ骰A(chǔ)上，嘗試將離子注入技術(shù)用于有機(jī)高分子材料表面改性。離子注入技術(shù)以往多用于金屬與合金材料的改性，它可選擇不同的離子源進(jìn)行注入改性，在改性材料表面形成微圖形結(jié)構(gòu)，使材料表面微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但并不影響基體材料本身的性質(zhì)，對(duì)于硅橡膠的表面改性具有較好的可行性。于是，在本研究中，我們采用了人體的組成性元素碳（C）對(duì)硅橡膠表面進(jìn)行注入處理，得到碳-硅橡膠（Carbon ion implanted silicone rubber，C-SR）。對(duì)改性后的材料采用掃描電鏡（Scanning electron microscope, SEM）、原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope,AFM）、傅立葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）觀察材料表面的微觀形貌情況；通過(guò)X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）等技術(shù)檢測(cè)分析了改性材料表面的物理化學(xué)性能狀態(tài)；同時(shí)采取了一系列試驗(yàn)對(duì)改性材料的細(xì)胞相容性進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)。以期能制備出一種符合臨床需要，且副反應(yīng)較少的新型軟組織填充材料。 研究方法 本研究分為四部分： 第一部分：SR和碳-硅橡膠（C-SR）材料的制備及微觀形貌觀察 1.選用室溫硫化雙組份醫(yī)用液態(tài)硅橡膠制備普通硅橡膠，室溫固化完全后選擇表面平整光滑、無(wú)缺損、無(wú)明顯雜質(zhì)的材料，選擇三種離子注入劑量（1015ions/cm2，3×1015ions/cm2，1016ions/cm2）對(duì)SR材料表面進(jìn)行離子注入，分別得到三種碳-硅橡膠改性材料（C-SR1、C-SR2及C-SR3）。 2.通過(guò)掃描電鏡（Scanning electron microscope, SEM）、原子力顯微鏡（AtomicForce Microscope, AFM）對(duì)改性材料表面的微觀形貌進(jìn)行觀察比較。 第二部分：SR及C-SR的表面理化性能檢測(cè) 采用傅立葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）、X射線衍射（X-ray diffraction, XRD）等技術(shù)及水接觸角分析檢測(cè)并評(píng)價(jià)純SR、C-SR1、C-SR2及C-SR3材料表面的理化性能，并采用SPSS20.0進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 第三部分：材料的細(xì)胞相容性評(píng)價(jià) 1.細(xì)胞準(zhǔn)備：應(yīng)用體外培養(yǎng)法培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，并將細(xì)胞接種于各材料表面培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2.實(shí)驗(yàn)分組情況為： 1）空白組：普通空白培養(yǎng)板中培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞； 2）SR組：SR材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞； 3）C-SR1組：C-SR1材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞； 4）C-SR2組：C-SR2材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞； 5）C-SR3組：C-SR3材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞。 3.通過(guò)激光共聚焦觀察各組改性材料表面細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白(actin)熒光表達(dá)情況，并采用CCK-8法檢測(cè)人真皮成纖維細(xì)胞在各組材料表面的增殖情況，對(duì)各組改性材料進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。 4.分別運(yùn)用免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)分析材料表面培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞中細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白OPN、Vinculin、Zyin及Talin的表達(dá)情況，對(duì)各組改性材料進(jìn)行生物功能性評(píng)價(jià)。 第四部分：材料細(xì)胞相容性提高的機(jī)制研究 1.采用免疫熒光染色檢測(cè)了在加入外源性O(shè)PN單克隆抗體或外源性重組OPN蛋白情況下，細(xì)胞骨架蛋白(actin)的表達(dá)情況，同時(shí)比較了各組材料表面細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞粘附的差異。 2.采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)了材料表面細(xì)胞外培養(yǎng)上清中有無(wú)OPN的表達(dá)及其表達(dá)有無(wú)差異。 3.采用Trans-well趨化試驗(yàn)檢測(cè)了OPN與MMP9是否能促進(jìn)細(xì)胞遷移，并通過(guò)明膠酶譜法檢測(cè)了各組材料表面細(xì)胞內(nèi)的MMP9活性高低情況。 4.在成功構(gòu)建了MMP9-RNAi模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)加入與未加入外源性重組OPN，采用激光共聚焦顯微鏡觀察比較OPN與MMP9的表達(dá)變化，并觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖及粘附變化。 研究結(jié)果 1.成功制備了SR，并采用多功能離子注入機(jī)在預(yù)先設(shè)定的條件下成功制備了三種不同離子注入條件的C-SR改性材料。 2.使用SEM觀察C-SR改性材料與SR比較，微觀形貌無(wú)明顯差異。進(jìn)一步用AFM觀察得到，SR表面呈光滑樣，稍有不平；碳離子注入后，C-SR材料表面呈現(xiàn)丘陵樣地形，“突起”分布隨離子注入劑量的增加而增多，但分布較為均勻。 3. FTIR結(jié)果顯示，C-SR各組改性材料與SR比較無(wú)明顯變化，提示C-SR并未改變SR的有機(jī)官能團(tuán)構(gòu)成；C-SR的XRD圖譜較SR有所改變，形成了新的峰，提示C離子的注入在SR表面形成了新的晶體結(jié)構(gòu)，但差異并不顯著；XPS分析顯示經(jīng)過(guò)了碳離子注入的C-SR其Si、C、O三種原子的峰均發(fā)生了變化，其中C原子的百分比隨離子注入劑量的增高峰值越高，Si原子的百分比隨離子注入劑量的增高峰值越低，說(shuō)明碳離子注入后取代了部分Si原子，改變了材料的表面化學(xué)成分；通過(guò)水接觸角分析得到，C-SR的水接觸角較SR明顯降低，說(shuō)明碳離子注入可以改善SR材料表面的疏水性。 4.采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組材料表面培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白（actin）的表達(dá)情況得出，C-SR表面培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)actin的熒光表達(dá)量明顯較SR強(qiáng)烈，且隨著改性材料C離子注入劑量的增多，其表達(dá)量越高。 5. CCK-8法檢測(cè)材料表面細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，C-SR表面培養(yǎng)的細(xì)胞較SR具有更好的細(xì)胞增殖能力，且隨著離子注入劑量的增加，其細(xì)胞增殖情況越好。 6.對(duì)各組材料表面培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白（OPN、Vinculin、Talin、Zyxin）等進(jìn)行免疫熒光染色及Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，C-SR材料表面細(xì)胞表達(dá)的粘附相關(guān)蛋白（OPN、Vinculin、Talin、Zyxin）均優(yōu)于SR，并隨著碳離子注入劑量的增加，蛋白表達(dá)量越高。 7. Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與SR組相比，C-SR1組、C-SR2組和C-SR3組的細(xì)胞中Vinculin-mRNA、OPN-mRNA表達(dá)明顯增高（P0.05），且在C-SR三組中比較，隨著離子注入劑量的增加，Vinculin mRNA、OPN mRNA表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。 8.在對(duì)OPN的作用研究中，我們加入外源性O(shè)PN單克隆抗體后，可觀察各組材料細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的表達(dá)水平均有所下降，且細(xì)胞的形態(tài)、粘附情況也受到影響，而在加入外源性重組OPN蛋白后可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。 9.采用Western Blot檢測(cè)到各組材料表面細(xì)胞外均有OPN的分泌，OPN可能在細(xì)胞外起橋梁蛋白作用，能夠調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白酶的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖與遷移。 10.采用Trans-well趨化試驗(yàn)檢測(cè)了OPN與MMP9的遷移能力，觀察到OPN與MMP9均具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用；進(jìn)一步在明膠酶譜試驗(yàn)中得到在C-SR材料上MMP9活性明顯高于SR。 11.成功構(gòu)建了MMP9-RNAi模型，并在此基礎(chǔ)上比較了加入與未加入外源性重組OPN蛋白情況下，觀察到未加入外源性重組OPN蛋白時(shí)，MMP9與OPN的表達(dá)水平均有所下降，細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)狀態(tài)、增殖情況也較差，在加入了外源性重組OPN后，上述情況明顯有所改善。表明，外源性O(shè)PN能上調(diào)MMP9表達(dá)，兩者共同參與了改性材料細(xì)胞相容性的提高。 結(jié)論： 1. C-SR改性材料制作方法較為簡(jiǎn)便，具有可加工性，可行性較好。 2. C-SR改性材料表面理化性能穩(wěn)定，既保持了SR的優(yōu)良特性，又改善了SR的疏水性能，使其具有更好的組織親和力。 3. C-SR改性材料表面培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、增殖能力、細(xì)胞粘附能力均優(yōu)于SR，說(shuō)明C-SR較SR具有更好的細(xì)胞相容性，更適合用于臨床的長(zhǎng)期植入以修復(fù)機(jī)體部位的缺損。 4.在對(duì)C-SR細(xì)胞相容性得到提高的機(jī)制研究中，我們認(rèn)為材料表面的理化性能發(fā)生改變后，影響了材料表面的微環(huán)境，進(jìn)而選擇性地增強(qiáng)了OPN及其他蛋白的吸附，而OPN通過(guò)與其受體發(fā)生特異性結(jié)合后介導(dǎo)了相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，上調(diào)了MMP9的表達(dá)，引起相應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)答，進(jìn)而提高了材料的細(xì)胞相容性。
【關(guān)鍵詞】：硅橡膠 離子注入 理化性質(zhì) 細(xì)胞粘附 細(xì)胞相容性 骨橋蛋白
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• Abstract7-13
• 摘要13-17
• 第一章 前言17-22
• 1.1 課題研究意義20
• 1.2 課題思路及研究?jī)?nèi)容20-22
• 第二章 碳-硅橡膠改性材料的制備及形貌觀察22-30
• 2.1 材料與方法22-23
• 2.2 結(jié)果23-28
• 2.3 討論28-29
• 2.4 小結(jié)29-30
• 第三章 碳-硅橡膠改性材料表面的理化性能研究30-40
• 3.1 材料與方法30-31
• 3.2 結(jié)果31-37
• 3.3 討論37-39
• 3.4 小結(jié)39-40
• 第四章 碳-硅橡膠改性材料的細(xì)胞相容性研究40-63
• 4.1 材料與方法40-51
• 4.2 結(jié)果51-60
• 4.3 討論60-62
• 4.4 小結(jié)62-63
• 第五章 碳-硅橡膠改性材料細(xì)胞相容性提高的機(jī)制研究63-83
• 5.1 材料與方法63-70
• 5.2 結(jié)果70-80
• 5.3 討論80-82
• 5.4 小結(jié)82-83
• 全文總結(jié)83-85
• 參考文獻(xiàn)85-93
• 文獻(xiàn)綜述93-100
• 參考文獻(xiàn)97-100
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章與獲得的專利100-101
• 致謝101

【參考文獻(xiàn)】

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