發(fā)布時(shí)間：2017-04-25 17:38

  本文關(guān)鍵詞：去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架構(gòu)建組織工程髓核的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：椎間盤退變是導(dǎo)致脊柱解剖和功能紊亂的重要原因,是一系列脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)。隨著人口老齡化以及人們生活節(jié)奏的加快,由其所致的脊柱疾患發(fā)病率越來(lái)越高,對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。因此,有關(guān)椎間盤退變性疾病的治療研究得到越來(lái)越多的關(guān)注,成為多學(xué)科的研究熱點(diǎn)。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展及治療進(jìn)行了廣泛而深入的基礎(chǔ)和臨床研究,但由于椎間盤退變是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程,目前臨床上既無(wú)有效的方法阻止其發(fā)生和發(fā)展,又無(wú)理想的措施來(lái)對(duì)椎間盤退變本身進(jìn)行合理的治療。傳統(tǒng)的治療方法包括保守治療及手術(shù)治療,保守治療以對(duì)癥治療為主,療效有限；手術(shù)治療包括單純髓核摘除或者化學(xué)溶解髓核組織、人工椎間盤置換等,因退變而致的脊柱不穩(wěn)采用植骨融合等。這些方法在一定程度上緩解了椎間盤退變性疾病(IDD)引起的的癥狀,但同時(shí)也造成脊柱解剖結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的破壞,從而導(dǎo)致節(jié)段活動(dòng)功能的喪失,加重鄰近節(jié)段的退變,并可能引起許多其他并發(fā)癥,且遠(yuǎn)期效果仍不確切。大量研究認(rèn)為椎間盤退變始于髓核,髓核的退變?cè)谟谒韬思?xì)胞數(shù)量減少及活力下降,進(jìn)而分泌細(xì)胞外基質(zhì)減少,細(xì)胞外基質(zhì)減少導(dǎo)致髓核含水量減少,髓核的彈性及緩沖壓力的能力減退,椎間盤高度降低,纖維環(huán)所受壓力增大,嚴(yán)重者可致纖維環(huán)變形、撕裂形成椎間盤突出或脫出。因此,以髓核為突破口,研究退變髓核的修復(fù)方法,或許是修復(fù)退變椎間盤的關(guān)鍵。近年來(lái),隨著國(guó)內(nèi)外組織工程技術(shù)和方法的不斷發(fā)展與創(chuàng)新,通過(guò)利用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有生物學(xué)功能的髓核,或許將為椎間盤退行性疾病的治療帶來(lái)新的希望。目前以下髓核組織工程支架研究較多,主要包括：1.人工合成材料支架,如PLA, PGA,明膠等；2.單一天然成分材料,如透明質(zhì)酸,二型膠原,殼聚糖等,3.人工-天然復(fù)合成分材料,如明膠-殼聚糖復(fù)合支架等。以上支架仍存在諸多不足,因?yàn)樘烊凰韬顺煞謴?fù)雜,很難完全模擬其微結(jié)構(gòu)、基質(zhì)成份及微環(huán)境,而去細(xì)胞基質(zhì)非常接近于正常髓核,在某些領(lǐng)域已研究較深入,取得重大進(jìn)展,例如在膀胱、血管、真皮、心瓣膜等取得較大成功并被批準(zhǔn)用于臨床,在軟骨方面亦有不少研究。但在組織工程髓核領(lǐng)域,檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有報(bào)道,我們猜想以去細(xì)胞髓核基質(zhì)為材料來(lái)源的支架是不是同樣能成功構(gòu)建組織工程髓核?并在此基礎(chǔ)上,將種子細(xì)胞接種至去細(xì)胞兔天然髓核支架,進(jìn)行體外構(gòu)建組織工程髓核。參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),脫細(xì)胞的方法很多,有酶消法、冷凍干燥法、去污劑處理法等,我們前期進(jìn)行了大量的預(yù)實(shí)驗(yàn),總結(jié)出一套理想的兔髓核脫細(xì)胞方法；但是我們發(fā)現(xiàn)單純脫細(xì)胞后獲得的兔髓核去細(xì)胞基質(zhì)存在明顯缺陷,即結(jié)構(gòu)致密,孔隙率及孔徑均很不理想。故我們?cè)诿摷?xì)胞基礎(chǔ)上創(chuàng)新,進(jìn)一步采用物理粉碎、溶解、離心、冷凍干燥成型、物理化學(xué)交聯(lián)等一系列處理制得去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架,它去除了髓核細(xì)胞及一些小分子免疫源性蛋白,因此具有良好的生物相容性,以及更低的細(xì)胞毒性,基本保留了天然髓核的原有細(xì)胞外基質(zhì)成分及局部微環(huán)境。它呈三維立體結(jié)構(gòu),擁有較好的力學(xué)性能及細(xì)胞所需微環(huán)境,并有理想的孔隙率及合適大小的孔徑,非常有利于種子的粘附、遷移。兔髓核取材方便,大小合適,國(guó)內(nèi)外制作兔椎間盤退變模型的方法成熟,已成為髓核組織工程研究的經(jīng)典模型。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類廣泛存在于造血系統(tǒng)具有多向分化能力的成體干細(xì)胞,取材簡(jiǎn)便,來(lái)源較廣,易于體外增殖,抗原性小,能夠基因修飾及多向分化,組織修復(fù)能力強(qiáng)等,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)都有報(bào)道利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞成功分化,因此是一種理想的種子細(xì)胞。目的：利用去污劑-核酸酶法脫細(xì)胞獲取去細(xì)胞髓核基質(zhì),進(jìn)一步物理粉碎、溶解、離心、冷凍干燥成型、物理化學(xué)交聯(lián)、輻照消毒制備去細(xì)胞兔髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架；接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架,體外模擬椎間盤生理低氧環(huán)境,含TGF-β1培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲取組織工程髓核；移植復(fù)合體至裸鼠皮下,觀察及評(píng)價(jià)復(fù)合體在體內(nèi)環(huán)境生長(zhǎng)情況。通過(guò)組織病理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)支架脫細(xì)胞情況及復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況,通過(guò)生物力學(xué)評(píng)價(jià)支架及支架-種子細(xì)胞復(fù)合體的生物力學(xué)特性；通過(guò)肉眼觀察支架及復(fù)合體的宏觀結(jié)構(gòu),掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu),并通過(guò)熒光定量分析樣本DNA總量評(píng)判細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖情況,實(shí)時(shí)熒光定量分析聚集蛋白聚糖及二型膠原mRNA含量,綜合評(píng)價(jià)去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的性能以及其應(yīng)用于髓核組織工程的可行性。方法：1.兔髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的制備。選取36只2.5-3kg的新西蘭大白兔做為髓核組織的供體來(lái)源,采用去污劑-核酸酶法對(duì)兔髓核組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理,根據(jù)課題組前期研究總結(jié)出的方案有效去除髓核細(xì)胞,且細(xì)胞外基質(zhì)成分損失較少。在原有脫細(xì)胞方案處理后進(jìn)行創(chuàng)新,進(jìn)一步將去細(xì)胞髓核基質(zhì)采用物理粉碎、溶解、離心、冷凍干燥成型、物理化學(xué)交聯(lián)、輻照消毒等一系列處理制得去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架。通過(guò)HE染色、DAPI染色判斷脫細(xì)胞程度,電鏡下觀察支架形態(tài)結(jié)構(gòu)、孔徑大小及空隙密度。通過(guò)吸水試驗(yàn)測(cè)定支架吸水率及孔隙率。通過(guò)配置不同濃度支架浸提液及完全培養(yǎng)基(空白對(duì)照)培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞增殖情況判斷支架的細(xì)胞毒性。2.接種骨髓間充干細(xì)胞至去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過(guò)添加TGF-β1等配置誘導(dǎo)培養(yǎng)基,并將細(xì)胞-支架復(fù)合體置于5%O2,5%CO2的厭氧培養(yǎng)箱中分別誘導(dǎo)培養(yǎng)4天、2周、4周。肉眼觀察細(xì)胞-支架復(fù)合體大體形態(tài)變化；通過(guò)熒光定量法檢測(cè)復(fù)合體DNA總量以判斷細(xì)胞增殖情況；誘導(dǎo)培養(yǎng)后4天,電鏡觀察細(xì)胞-支架復(fù)合體中細(xì)胞在支架上的黏附、增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況；通過(guò)活死細(xì)胞染色法觀察細(xì)胞在支架的存活情況；分別取出2周、4周組的細(xì)胞-支架復(fù)合體,通過(guò)HE染色、DAPI染色、阿利新蘭染色、二型膠原免疫組化染色等病理組織學(xué)技術(shù),以及二型膠原、聚集蛋白聚糖mRNA實(shí)時(shí)熒光定量等分析體外培養(yǎng)復(fù)合體的形態(tài)變化,細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。3.將部分在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后的細(xì)胞-支架復(fù)合體以及去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架(空白對(duì)照組)移植入4周齡大小的裸鼠皮下肌膜層,取復(fù)合體移植4周后的裸鼠行活體成像檢測(cè)；分別取出移植2周、4周的復(fù)合體樣本進(jìn)行觀察。包括通過(guò)肉眼觀察細(xì)胞-支架復(fù)合體大體形態(tài)變化；通過(guò)HE染色、DAPI染色、阿利新蘭染色、二型膠原免疫組化染色等病理組織學(xué)技術(shù),以及二型膠原、聚集蛋白聚糖mRNA實(shí)時(shí)熒光定量分析等評(píng)價(jià)體內(nèi)移植物的形態(tài)變化,細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。結(jié)果：第一部分：去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的大體觀及基本特征。肉眼觀見(jiàn)支架呈圓柱狀,乳白色,富有彈性,類似海綿,光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)支架為多孔結(jié)構(gòu),孔隙相互貫通,交界處結(jié)合緊密,中央脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲相互連接,形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)吸水試驗(yàn)測(cè)定的細(xì)胞吸水率為272.16±33.30%,孔隙率為81.28±4.10%。電鏡下孔隙相互貫通,空隙直徑在100-450um之間。HE染色結(jié)果顯示細(xì)胞外基質(zhì)淡紅染,細(xì)胞核及細(xì)胞殘留物去除較為徹底,DAPI染色顯示幾乎無(wú)細(xì)胞核殘留,表明脫細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架細(xì)胞去除徹底,擁有良好的三維立體結(jié)構(gòu)及理想的吸水率、空隙率及孔徑大小。第二部分：體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-支架復(fù)合體的性能評(píng)估。肉眼下細(xì)胞-支架復(fù)合體隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),復(fù)合體體積縮小,質(zhì)地變得更加致密,2周左右形成一個(gè)實(shí)心圓餅狀的類髓核組織。掃描電鏡下觀察接種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞4天的細(xì)胞-支架復(fù)合體,將支架橫行切割成2份,復(fù)合體表面及橫截面均可見(jiàn)細(xì)胞大量粘附在支架微絲結(jié)構(gòu)中,多數(shù)呈扁平狀,少數(shù)呈不規(guī)則型或圓形。活死細(xì)胞染色觀察體外培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合體結(jié)果表明種子細(xì)胞在支架上存活良好,且分布均勻,死亡細(xì)胞極少；DNA熒光定量分析結(jié)果表明樣本DNA含量增加呈時(shí)間依賴性；將體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的復(fù)合體樣本切片HE染色、DAPI染色結(jié)果顯示種子細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量增加,細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加。阿利新藍(lán)染色、二型膠原免疫組化染色均表明隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞外特異性髓核基質(zhì)成分糖胺聚糖及二型膠原分泌逐漸增加。復(fù)合體及單純支架(空白對(duì)照)彈性模量顯示隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),復(fù)合體彈性增加,但均與正常髓核彈性模量存在差異,其中培養(yǎng)4周后的復(fù)合體彈性接近正常。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明聚集蛋白聚糖及二型膠原mRNA分泌量呈時(shí)間依賴性增加。第三部分：體內(nèi)種植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-支架復(fù)合體的性能評(píng)估。移植入裸鼠皮下肌膜的復(fù)合體樣本切片HE染色、DAPI染色結(jié)果顯示種子細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量增加,細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加。阿利新藍(lán)染色、二型膠原免疫組化染色均表明隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞外特異性髓核基質(zhì)成分糖胺聚糖及二型膠原分泌逐漸增加。同樣實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明聚集蛋白聚糖及二型膠原mRNA分泌量呈時(shí)間依賴性增加。結(jié)論：1.骨髓間充干細(xì)胞來(lái)源穩(wěn)定,增殖快,可在含TGF-β1的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及低氧環(huán)境中分化為類髓核細(xì)胞,并分泌大量髓核細(xì)胞外基質(zhì),可以作為理想的種子細(xì)胞來(lái)源；2.利用去污劑-核酸酶法可以有效去除髓核細(xì)胞,且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)損耗小,利用粉碎、冷凍干燥、物理化學(xué)交聯(lián)可以成功制備髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架,該支架具有疏松多孔立體結(jié)構(gòu),生物力學(xué)性能良好,無(wú)細(xì)胞毒性,且保留了大部分髓核細(xì)胞外基質(zhì)成分,可以作為髓核組織工程的支架來(lái)源；3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架,在低氧條件下,置于含TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng),可成功向類髓核細(xì)胞分化、增殖；4.兔骨髓間充干細(xì)胞復(fù)合髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架裸鼠體內(nèi)種植,種子細(xì)胞在支架內(nèi)大量增殖,細(xì)胞分布均勻,部分形成簇狀結(jié)構(gòu),且大量分泌合成髓核特異性基質(zhì)蛋白聚集蛋白聚糖及二型膠原,活體成像顯示體內(nèi)種植4周后復(fù)合體仍然強(qiáng)熒光,表明種子細(xì)胞存活良好,且移植物形態(tài)致密,富有彈性,類似髓核組織,故兔骨髓間充干細(xì)胞復(fù)合髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架在裸鼠體內(nèi)成功分化為類髓核組織。
【關(guān)鍵詞】：椎間盤 髓核 脫細(xì)胞 去細(xì)胞基質(zhì) 組織工程
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.53;R318.08
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-25
• 參考文獻(xiàn)22-25
• 第一章 兔髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的制備25-36
• 1. 材料和方法25-31
• 2. 結(jié)果31-33
• 3. 討論33-36
• 第二章 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的體外培養(yǎng)36-62
• 1. 材料和方法36-47
• 2 結(jié)果47-59
• 3 討論59-62
• 第三章 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的體內(nèi)種植62-71
• 1. 材料跟方法62-63
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法63-64
• 3. 結(jié)果64-69
• 4. 討論69-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 全文總結(jié)77-78
• 實(shí)驗(yàn)不足與展望78-79
• 中英文縮略詞對(duì)照表79-80
• 綜述80-96
• 參考文獻(xiàn)91-96
• 攻讀學(xué)位期間成果96-97
• 致謝97-99

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 余兆仲;李放;王龍劍;馬周涌;;椎間盤組織工程支架材料的研究進(jìn)展[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年48期

2 伍耀宏;徐寶山;楊強(qiáng);李秀蘭;張楊;夏群;許海委;;脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)來(lái)源的多孔支架復(fù)合山羊髓核細(xì)胞體內(nèi)初步構(gòu)建組織工程髓核的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)矯形外科雜志;2013年13期

  本文關(guān)鍵詞：去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架構(gòu)建組織工程髓核的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：326748