基因治療在多種疾病的治療領(lǐng)域具有重大潛力。然而基因治療的應(yīng)用卻因為缺乏體內(nèi)無創(chuàng)檢測基因表達水平的方法而受到諸多限制。MRI可以提供高分辨率和組織器官的的特異性功能成像,這些特點使MRI報告基因的應(yīng)用成為了監(jiān)測基因表達的首選成像方式。最近幾年,這方面的報道很多,包括β-半乳糖苷酶,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體以及鐵蛋白等的研究。其中在諸多基因中,鐵蛋白,由于其不需要其他補充試劑,無細胞毒性,成為了最有吸引力的MRI報告基因。本研究希望可以構(gòu)建一個GFP和重鏈鐵蛋白雙表達的載體系統(tǒng),既滿足體外研究的需要,也滿足在體內(nèi)無創(chuàng)成像的需要。方法：使用限制性內(nèi)切酶得到鐵蛋白重鏈基因片段,使用T4連接酶將其連接到pBI-CMV2載體中,構(gòu)建成質(zhì)粒pBI-GFP-mFerritin。構(gòu)建成功后,經(jīng)菌落PCR,酶切,測序鑒定載體。利用脂質(zhì)體,將正確載體轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中,進行免疫化學及體外功能分析,鑒定小鼠鐵蛋白重鏈基因在細胞的表達分布。之后,將純化好的高質(zhì)量質(zhì)粒,通過電轉(zhuǎn)染的方式,轉(zhuǎn)染到小鼠大腿。48小時后,在MR下檢測T2圖像。通過對大腿組織常規(guī)切片進行普魯士藍染色實驗,顯示腿部肌肉中的鐵。結(jié)論：經(jīng)菌落PCR和酶... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 分子影像和報告基因成像
    1.2 MRI原理
    1.3 MRI造影劑
    1.4 FERRITIN結(jié)構(gòu)與功能
        1.4.1 Ferritin的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 Ferritin氧化還原
        1.4.3 Ferritin中鐵離子的釋放
    1.5 FERRITIN磁共振成像原理
    1.6 FERRITIN在MR成像中的應(yīng)用
2 實驗材料與方法
    2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.1.1 mFerritin片段的獲得
        2.1.2 pBI-CMV2載體酶切
        2.1.3 連接
        2.1.4 轉(zhuǎn)化
        2.1.5 菌落PCR
        2.1.6 酶切鑒定
        2.1.7 測序正確后提取質(zhì)粒
        2.1.8 細菌保種
    2.2 細胞轉(zhuǎn)染及MFERRITIN蛋白體外試驗
        2.2.1 細胞復(fù)蘇、傳代和凍存
        2.2.2 細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.3 Western Blot免疫印跡實驗
        2.2.4 細胞MR成像
        2.2.5 細胞GFP成像
    2.3 MFERRITIN在體內(nèi)共振成像檢測
        2.3.1 小鼠體內(nèi)電轉(zhuǎn)染實驗
        2.3.2 小鼠體內(nèi)MRI掃描
        2.3.3 組織切片Prussian Blue實驗
3.結(jié)果
    3.1 菌落PCR
    3.2 限制性內(nèi)切酶初步鑒定重組載體
    3.3 載體測序結(jié)果
    3.4 轉(zhuǎn)染后GFP表達情況
    3.5 MFERRITIN-H蛋白表達的檢測
    3.6 MFERRITIN-H體外表達的MR檢測
    3.7 MFERRITIN-H體內(nèi)表達的MR檢測
    3.8 MFERRITIN-H體內(nèi)表達的PRUSSIAN BLUE染色
4 討論
    4.1 載體構(gòu)建
    4.2 體外實驗
    4.3 體內(nèi)實驗
5 結(jié)論與展望
致謝
參考文獻
作者介紹



本文編號：3107909