基因治療在多種疾病的治療領(lǐng)域具有重大潛力。然而基因治療的應(yīng)用卻因?yàn)槿狈w內(nèi)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法而受到諸多限制。MRI可以提供高分辨率和組織器官的的特異性功能成像,這些特點(diǎn)使MRI報(bào)告基因的應(yīng)用成為了監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的首選成像方式。最近幾年,這方面的報(bào)道很多,包括β-半乳糖苷酶,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體以及鐵蛋白等的研究。其中在諸多基因中,鐵蛋白,由于其不需要其他補(bǔ)充試劑,無(wú)細(xì)胞毒性,成為了最有吸引力的MRI報(bào)告基因。本研究希望可以構(gòu)建一個(gè)GFP和重鏈鐵蛋白雙表達(dá)的載體系統(tǒng),既滿足體外研究的需要,也滿足在體內(nèi)無(wú)創(chuàng)成像的需要。方法：使用限制性內(nèi)切酶得到鐵蛋白重鏈基因片段,使用T4連接酶將其連接到pBI-CMV2載體中,構(gòu)建成質(zhì)粒pBI-GFP-mFerritin。構(gòu)建成功后,經(jīng)菌落PCR,酶切,測(cè)序鑒定載體。利用脂質(zhì)體,將正確載體轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中,進(jìn)行免疫化學(xué)及體外功能分析,鑒定小鼠鐵蛋白重鏈基因在細(xì)胞的表達(dá)分布。之后,將純化好的高質(zhì)量質(zhì)粒,通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方式,轉(zhuǎn)染到小鼠大腿。48小時(shí)后,在MR下檢測(cè)T2圖像。通過(guò)對(duì)大腿組織常規(guī)切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn),顯示腿部肌肉中的鐵。結(jié)論：經(jīng)菌落PCR和酶... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：44 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 分子影像和報(bào)告基因成像
    1.2 MRI原理
    1.3 MRI造影劑
    1.4 FERRITIN結(jié)構(gòu)與功能
        1.4.1 Ferritin的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 Ferritin氧化還原
        1.4.3 Ferritin中鐵離子的釋放
    1.5 FERRITIN磁共振成像原理
    1.6 FERRITIN在MR成像中的應(yīng)用
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.1.1 mFerritin片段的獲得
        2.1.2 pBI-CMV2載體酶切
        2.1.3 連接
        2.1.4 轉(zhuǎn)化
        2.1.5 菌落PCR
        2.1.6 酶切鑒定
        2.1.7 測(cè)序正確后提取質(zhì)粒
        2.1.8 細(xì)菌保種
    2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及MFERRITIN蛋白體外試驗(yàn)
        2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代和凍存
        2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.2.3 Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)
        2.2.4 細(xì)胞MR成像
        2.2.5 細(xì)胞GFP成像
    2.3 MFERRITIN在體內(nèi)共振成像檢測(cè)
        2.3.1 小鼠體內(nèi)電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
        2.3.2 小鼠體內(nèi)MRI掃描
        2.3.3 組織切片Prussian Blue實(shí)驗(yàn)
3.結(jié)果
    3.1 菌落PCR
    3.2 限制性內(nèi)切酶初步鑒定重組載體
    3.3 載體測(cè)序結(jié)果
    3.4 轉(zhuǎn)染后GFP表達(dá)情況
    3.5 MFERRITIN-H蛋白表達(dá)的檢測(cè)
    3.6 MFERRITIN-H體外表達(dá)的MR檢測(cè)
    3.7 MFERRITIN-H體內(nèi)表達(dá)的MR檢測(cè)
    3.8 MFERRITIN-H體內(nèi)表達(dá)的PRUSSIAN BLUE染色
4 討論
    4.1 載體構(gòu)建
    4.2 體外實(shí)驗(yàn)
    4.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
5 結(jié)論與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
作者介紹



本文編號(hào)：3107909