本文關鍵詞：大鼠BMSCs成骨誘導及復合支架構(gòu)建組織工程骨的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本研究以納米羥基磷灰石、膠原蛋白、絲素蛋白為原料制備仿生骨組織工程三維支架,并評價支架材料的孔隙率、孔徑大小、吸水率及生物力學性能。提取Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞并成骨方向誘導,檢測細胞形態(tài)變化、堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)染色及I型膠原和骨鈣素表達鑒定成骨誘導活性。將成骨方向誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞與制備支架復合培養(yǎng)以檢測其細胞生物相容性及構(gòu)建組織工程化骨的可行性。方法:1.三維支架材料的制備:冷凍干燥法制備納米羥基磷灰石、膠原蛋白、絲素蛋白(Nano-HA、COL、SF)質(zhì)量比分別為1:1:5(A組)、1:2:5(B組)及1:3:5(C組)三組復合支架。改良液體位移法測定支架孔隙率;質(zhì)量差值法測量吸水膨脹率;Instron5865力學試驗機測定力學性能;掃描電鏡(SEM)觀察支架內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。2.大鼠BMSCs細胞的提取及培養(yǎng):脫頸法處死Wistar大鼠,無菌條件下提取股骨、脛骨內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞,以10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng),并傳代,傳至第3代,待用。3.BMSCs細胞成骨方向誘導干預及分組:取生長良好的第3代BMSCs細胞,按1×105L-1的細胞濃度接種于無菌24孔板內(nèi),分為實驗組與對照組2組;每組12孔,每組再各分4個亞組,需要染色的組別預先在孔內(nèi)放入經(jīng)滅菌處理的蓋玻片。分別對各相應組內(nèi)細胞作堿性磷酸酶(ALP)染色,鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色,以及I型膠原和骨鈣素表達的檢測。干預措施為:實驗組以含成骨誘導劑的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng);對照組則僅用含胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組均每3天換細胞培養(yǎng)液1次,換液量相等。4.成骨誘導后的細胞接種于三維支架復合培養(yǎng),分別于培養(yǎng)后的第2、4、6、8、12d做MTT細胞活性檢測;另外取培養(yǎng)第8d的復合培養(yǎng)物作掃描電鏡觀察以及組織HE切片染色。結(jié)果:1.三組支架材料均為三維多孔結(jié)構(gòu),具有一定的孔徑及孔隙率。B組支架更符合要求:孔徑98~260μm,平均孔徑為177μm;孔隙率為(96.72±2.78)%;吸水膨脹率為(549.37±35.29)%;生物力學試驗機測定其力學性能穩(wěn)定、壓縮應變以及彈性模量等指標適宜骨組織工程研究應用。2.提取BMSCs細胞及誘導培養(yǎng):提取的BMSCs原代細胞為單個核細胞,形態(tài)大部分為球形,25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)體外培養(yǎng)1~3天后,可見細胞呈橢圓形、球形貼壁生長。繼續(xù)培養(yǎng)后,圓形貼壁細胞的數(shù)量明顯減少。培養(yǎng)5~7天后,形態(tài)以梭形為主。成骨誘導第2~3天后細胞形態(tài)發(fā)生改變,由梭形變?yōu)槎嘟切?7天時以多角形為主。ALP染色可見多個胞質(zhì)內(nèi)、細胞核內(nèi)染色均呈陽性表現(xiàn)。培養(yǎng)21天后作細胞爬片的茜素紅染色鈣結(jié)節(jié),可見細胞染色呈深紅色或橘紅色的鈣鹽沉積,細胞與細胞之間呈團塊狀。結(jié)節(jié)團塊的大小及形態(tài)不一,數(shù)個或多個礦化結(jié)節(jié)可融合成塊。經(jīng)檢測I型膠原和骨鈣素表達均呈陽性。3.誘導細胞與支架復合培養(yǎng)后掃描電鏡及HE切片染色結(jié)果顯示,支架內(nèi)有大量細胞長入,生長狀態(tài)良好,完全伸展。支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)被一層細胞基質(zhì)覆蓋,孔與孔之間有細胞長入。MTT檢測結(jié)果為細胞在一定時間內(nèi)呈對數(shù)生長。結(jié)論:1.三組支架均為三維多孔結(jié)構(gòu),B組支架在孔徑大小、孔隙率及力學性能等方面更適用于骨組織工程需求。2.經(jīng)檢測ALP、鈣結(jié)節(jié)及骨鈣素等指標驗證所得細胞為成骨活性細胞,同時反向驗證提取細胞為BMSCs,可用于構(gòu)建骨組織工程化骨組織。3.細胞/支架復合培養(yǎng)后,細胞在支架內(nèi)部生長良好,且分泌細胞外基質(zhì)。該構(gòu)建復合物有望應用于修復骨組織缺損。
【關鍵詞】：納米羥基磷灰石 膠原蛋白 絲素蛋白 組織工程支架 骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨誘導
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R68;R318.08
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 縮略語/符號說明9-10
• 前言10-14
• 研究現(xiàn)狀、成果10-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、Nano-HA/COL/SF復合三維多孔支架的制備14-28
• 1.1 對象和方法14-17
• 1.1.1 實驗材料14
• 1.1.2 實驗方法14-16
• 1.1.3 孔隙率、孔徑大小等理化性能檢測16-17
• 1.1.4 三維支架的生物力學檢測17
• 1.1.5 統(tǒng)計學方法17
• 1.2 結(jié)果17-24
• 1.2.1 Nano-HA/COL/SF復合三維支架吸水膨脹率結(jié)果17-18
• 1.2.2 Nano-HA/COL/SF復合三維支架孔隙率結(jié)果18
• 1.2.3 Nano-HA/COL/SF復合三維支架物理大體外觀18
• 1.2.4 Nano-HA/COL/SF復合三維支架孔徑大小及微觀結(jié)構(gòu)18-19
• 1.2.5 Nano-HA/COL/SF復合三維支架的生物力學測試結(jié)果19-24
• 1.3 討論24-27
• 1.3.1 支架材料復合的必要性24-25
• 1.3.2 支架材料制備的方法25-26
• 1.3.3 組織工程支架評價指標26-27
• 1.4 小結(jié)27-28
• 二、大鼠BMSCs細胞的提取培養(yǎng)及成骨方向誘導28-38
• 2.1 對象和方法28-31
• 2.1.1 實驗材料28-29
• 2.1.2 實驗方法29-30
• 2.1.3 BMSCs誘導后檢測其成骨性30-31
• 2.1.4 統(tǒng)計學方法31
• 2.2 結(jié)果31-35
• 2.2.1 細胞形態(tài)變化觀察31
• 2.2.2 堿性磷酸酶（ALP）染色結(jié)果31
• 2.2.3 茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色31
• 2.2.4 I型膠原蛋白Western blotting結(jié)果31
• 2.2.5 骨鈣素檢測結(jié)果31-35
• 2.3 討論35-37
• 2.3.1 種子細胞的選擇與誘導35-36
• 2.3.2 BMSCs細胞誘導后鑒定結(jié)果的討論36-37
• 2.4 小結(jié)37-38
• 三、成骨誘導細胞與支架復合培養(yǎng)及檢測38-44
• 3.1 對象和方法38-39
• 3.1.1 實驗對象38
• 3.1.2 實驗方法38-39
• 3.1.3 統(tǒng)計學方法39
• 3.2 結(jié)果39-42
• 3.2.1 MTT法檢測細胞增殖結(jié)果39-40
• 3.2.2 電鏡掃描及HE切片結(jié)果40-42
• 3.3 討論42-43
• 3.3.1 組織工程構(gòu)建方式的討論42
• 3.3.2 用于檢測細胞-支架培養(yǎng)情況指標的討論42-43
• 3.4 小結(jié)43-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-56
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明56-58
• 綜述 組織工程骨研究背景與進展58-67
• 綜述參考文獻65-67
• 致謝67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關鍵詞：大鼠BMSCs成骨誘導及復合支架構(gòu)建組織工程骨的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：306170