本文關(guān)鍵詞：同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細胞復(fù)合β-磷酸三鈣支架修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及多向誘導(dǎo)分化研究目的：建立體外分離培養(yǎng)獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞(rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells, rADSCs)的方法,并對其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性進行觀察并對其表面標(biāo)志物進行鑒定；將分離培養(yǎng)的rADSCs體外誘導(dǎo),使其向成骨、成脂方向分化,觀察其多向細胞分化的潛能。方法：切取兔頸背區(qū)皮下脂肪,用0.1%I型膠原酶消化法獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞,進行體外培養(yǎng),用胰蛋白酶消化法傳代擴增。用CCK-8法細胞增殖實驗繪制細胞增殖曲線。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞表面標(biāo)志物。第4代rADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后,用油紅0染色,成骨誘導(dǎo)后,分別用茜素紅染色、堿性磷酸酶染色,觀察其成骨、成脂分化潛能。結(jié)果：rADSCs細胞呈長梭形漩渦樣貼壁生長,增殖能力強。將第4代rADSCs用分子流式細胞儀檢測,可見CD29、CD90、CD44陽性率高,而CD34和CD45陽性率低。第4代rADSCs在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下分化為脂肪細胞和成骨細胞,成脂誘導(dǎo)后的rADSCs經(jīng)油紅0染色呈陽性結(jié)果,成骨誘導(dǎo)后的rADSCs經(jīng)堿性磷酸酶和茜素紅染色均呈陽性結(jié)果。結(jié)論：來源于兔頸背區(qū)的皮下脂肪組織取材相對容易且可供取材的組織量大,脂肪組織內(nèi)細胞量充足,可簡單進行體外分離培養(yǎng)；兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞(rADSCs)在體外增殖速度快,能夠保持穩(wěn)定的傳代,直至第10代；ADSCs具有分化成骨細胞、成脂細胞等多向細胞分化的潛能,是組織工程骨理想的種子細胞。第二部分兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞在β-磷酸三鈣支架上體外共培養(yǎng),構(gòu)建rADSCs/ β-TCP骨組織工程復(fù)合體及體外成骨分化的研究目的： 將β-磷酸三鈣(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)支架與經(jīng)傳代分離獲取的兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞在體外共培養(yǎng),構(gòu)建成rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體,觀察在組織工程支架上rADSCs向成骨細胞分化的能力。方法：將體外分離培養(yǎng)的rADSCs接種于β-TCP支架上,從在β-TCP支架上加入細胞懸液開始計時,在細胞培養(yǎng)的第24h開始,每24h至第7d進行CCK-8檢測細胞在材料中的增殖情況,培養(yǎng)7d后用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)測定試劑盒檢測細胞在材料內(nèi)表達ALP的情況,以rADSCs直接接種于12孔板培養(yǎng)貼壁生長作為對照組,在相同時間點進行細胞增殖以及ALP活性的檢測,結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。將rADSCs細胞懸液接種于β-TCP支架上,在體外共培養(yǎng)3d和7d,在掃描電鏡下觀察其生長情況。結(jié)果：經(jīng)CCK-8法檢測,細胞在支架材料上增殖的結(jié)果示：各組的吸光度都隨時間延長而逐漸升高,與β-TCP支架共培養(yǎng)7d的細胞與對照組相比較,第2天、第5天細胞與支架材料共培養(yǎng)組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,在支架材料上的細胞增殖能力較強,其余時間點的兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；并且隨著時間的延長,細胞的增殖不受影響并具有良好的生物學(xué)活性。ALP活性測定結(jié)果表明,接種的rADSCs細胞在β-TCP支架上生長良好,具有較高的ALP活性,與對照相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,β-TCP具有一定的促進細胞成骨作用。掃描電鏡觀察細胞與材料接觸緊密,細胞呈長梭形伸展,分布均勻。結(jié)論：β-TCP支架具有良好的生物相容性,rADSCs在支架上共培養(yǎng)時支架材料不具有細胞毒性;rADSCs在β-TCP支架上共培養(yǎng)后,細胞的增殖能力無明顯減弱,并且仍具有向成骨分化的能力。第三部分應(yīng)用rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實驗研究目的：以β-TCP陶瓷為支架材料,復(fù)合兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞,探討構(gòu)建組織工程骨修復(fù)骨缺損的可行性。方法：體外培養(yǎng)的兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞(rADSCs)接種于β-TCP支架上,構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體,并進行體外培養(yǎng)。制備兔橈骨2cm長度的節(jié)段性骨缺損模型,分三組進行骨缺損治療的研究：空白對照組(A組)不植入任何材料,單β-TCP人工骨對照組(B組),rADSCs/β-TCP復(fù)合體實驗組(C組)。各組8只兔16例骨缺損。在手術(shù)后2周,4周,6周和8周時進行X線檢查,按Lane-Sandhu X線評分法對骨愈合情況進行比較,X線檢查后每組各選2只兔處死后取出標(biāo)本,對標(biāo)本進行大體觀察以及進行常規(guī)HE染色,光鏡下觀察骨修復(fù)情況,并觀察是否發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果：通過Lane-SandhuX線評分進行統(tǒng)計學(xué)分析,C組比B組在各時間點評分均略高,但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義,其兩組的評分均明顯高于A組,手術(shù)后8周結(jié)果示A組與其它兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。組織學(xué)觀察C組在術(shù)后4周可觀察到骨缺損周圍開始形成新生骨,并隨著時間的延長新生骨量逐漸增多,在術(shù)后6周時,材料逐漸降解,材料孔隙內(nèi)有新生骨長入,在術(shù)后8周時,材料降解明顯,材料孔隙基本消失,髓腔已基本再通。而至術(shù)后8周,2例B組及4例A組骨缺損未愈合,髓腔不通,與實驗組有明顯差異。組織學(xué)檢測未見免疫排斥現(xiàn)象。結(jié)論：將同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細胞為種子細胞,接種于β-TCP支架材料構(gòu)建骨組織工程復(fù)合體,移植修復(fù)兔橈骨大段骨缺損部位。術(shù)后8周骨缺損部位完全修復(fù),髓腔再通及塑形基本完成。組織學(xué)檢測未見免疫排斥現(xiàn)象；ADSCs有望成為理想的修復(fù)骨缺損、促進骨折愈合的組織工程骨所需要的種子細胞,為大段骨缺損組織工程的修復(fù)提供可行的技術(shù)方案,為臨床治療骨缺損提供新的方法。
【關(guān)鍵詞】：脂肪源性間充質(zhì)干細胞 成脂分化 成骨分化 流式細胞儀 脂肪源性間充質(zhì)干細胞 β-磷酸三鈣 骨組織工程 脂肪源性間充質(zhì)干細胞 骨組織工程復(fù)合體 大段骨缺損 β-磷酸三鈣
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：Q813.11;R318.08
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-13
• 前言13-15
• 第一部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及多向誘導(dǎo)分化研究15-30
• 1 實驗材料15-16
• 2 實驗方法16-21
• 3 結(jié)果21-27
• 4 討論27-29
• 5 小結(jié)29-30
• 第二部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞在β-磷酸三鈣支架上體外共培養(yǎng),構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體及體外成骨分化的研究30-38
• 1 實驗材料30-31
• 2 實驗方法31-33
• 3 結(jié)果33-36
• 4 討論36-37
• 5 小結(jié)37-38
• 第三部分 應(yīng)用rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實驗研究38-54
• 1 實驗材料38-39
• 2 實驗方法39-42
• 3 結(jié)果42-51
• 4 討論51-52
• 5 小結(jié)52-54
• 參考文獻54-56
• 綜述56-61
• 參考文獻59-61
• 致謝61-62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 畢曉娟;馬艷;江明;;大鼠腹股溝脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及活體標(biāo)記[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年14期

  本文關(guān)鍵詞：同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細胞復(fù)合β-磷酸三鈣支架修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：301280