發(fā)布時間：2021-01-11 22:47

　　研究一 Beagle犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定目的:探討B(tài)eagle犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的體外分離、培養(yǎng)條件以及生物學(xué)特性的相關(guān)鑒定。方法:Beagle犬使用戊巴比妥鈉麻醉（30mg/Kg）成功后,濃度8%的硫化鈉液脫毛、溫清水擦拭、碘伏液消毒后鋪無菌巾單,無菌操作下,選用16號骨髓穿刺針,分別自左右兩側(cè)髂嵴抽取Beagle犬骨髓血,注入含肝素和DMEM/F12的離心管內(nèi),采用全骨髓血聯(lián)合貼壁法培養(yǎng)Beagle犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞:骨髓血以1500轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,棄上清,加入DMEM/F12適量。再以1200轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,棄上清液,計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為5×10-1mL,加入完全培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基主要成分包括:DMEM\F12培養(yǎng)液（HYCLONE公司,USA）、10%的胎牛血清（HYCLONE公司,USA）、青鏈霉素混合液（Solarbio公司,pH=7.2）,制成細(xì)胞懸液,吹打混勻后接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),置于37℃,含5%C02培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48小時后首次給予全量換液,以后每48小時至72小時、培養(yǎng)基變黃時換液1次。當(dāng)細(xì)胞融合至80%,采用0.... 

【文章來源】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文獻(xiàn)研究
    1.1 目前軟骨缺損的修復(fù)技術(shù)
        1.1.1 微骨折技術(shù)
        1.1.2 自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)
        1.1.3 膜支架技術(shù)
    1.2 未來軟骨再生方法的研究
        1.2.1 體外軟骨細(xì)胞-支架材料復(fù)合體
        1.2.2 細(xì)胞及組織的替代物
            1.2.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
            1.2.2.2 其他來源的干細(xì)胞
            1.2.2.3 自體外周血干細(xì)胞
            1.2.2.4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
            1.2.2.5 同種異體移植物
            1.2.2.6 創(chuàng)新型無細(xì)胞的生物材料
            1.2.2.7 自體誘導(dǎo)軟骨形成術(shù)
        1.2.3 無支架方式的研究
    1.3 結(jié)論
第二章 種子細(xì)胞的研究 Beagle犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗動物
        2.2.2 主要儀器
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 本部分實驗所需培養(yǎng)液、緩沖液及工作液的配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 Beagle犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離及原代培養(yǎng)
        2.3.2 Beagle犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        2.3.3 Beagle犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定
            2.3.3.1 倒置顯微鏡觀察
            2.3.3.2 免疫熒光化學(xué)染色
            2.3.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶染色
            2.3.3.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色
            2.3.3.5 流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)
        2.3.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖
    2.4 實驗數(shù)據(jù)的整理與統(tǒng)計分析
    2.5 結(jié)果
        2.5.1 倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
        2.5.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果
        2.5.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞蘇木精-伊紅染色鑒定結(jié)果
        2.5.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果
        2.5.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶染色結(jié)果
        2.5.6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果
        2.5.7 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果
        2.5.8 CCK-8檢測細(xì)胞增殖結(jié)果
    2.6 討論
第三章 中藥支架材料的研究 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架-骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合體的體外實驗研究
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗器材
        3.2.2 主要試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 殼聚糖的制備
        3.3.2 海藻酸鈉的制備
        3.3.3 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架材料的制備
        3.3.4 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架形態(tài)觀察
        3.3.5 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)
        3.3.6 掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）觀察中藥提取物支架材料上細(xì)胞生長情況
            3.3.6.1 掃描電鏡觀察實驗
            3.3.6.2 透射電鏡觀察實驗
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 殼聚糖、海藻酸鈉制備以及制備完成的中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架大體形態(tài)觀察結(jié)果
        3.4.2 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架材料形貌觀察結(jié)果
        3.4.3 倒置顯微鏡、掃描電鏡（SEM）觀察支架材料上細(xì)胞生長情況結(jié)果
            3.4.3.1 倒置顯微鏡觀察支架材料上細(xì)胞生長情況結(jié)果
            3.4.3.2 掃描電鏡（SEM）觀察中藥提取物支架材料上細(xì)胞生長情況結(jié)果
    3.5 討論
第四章 動物實驗研究 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合體修復(fù)Beagle犬股骨頭軟骨缺損的動物實驗研究
    4.1 前言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗器材
        4.2.2 主要試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架材料的準(zhǔn)備及預(yù)處理
        4.3.2 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有機(jī)復(fù)合體的構(gòu)建
        4.3.3 Beagle犬股骨頭軟骨缺損模型的建立
        4.3.4 觀察指標(biāo)的選擇
            4.3.4.1 實驗動物的一般情況
            4.3.4.2 修復(fù)軟骨缺損的股骨頭大體形態(tài)檢測
            4.3.4.3 標(biāo)本組織學(xué)檢查
                4.3.4.3.1 蘇木精-伊紅染色（HE染色）方法
                4.3.4.3.2 軟骨染色液（甲苯胺藍(lán)法）染色方法
                4.3.4.3.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色（SABC法）方法
                4.3.4.3.4 透射電鏡觀察實驗方法
    4.4 實驗數(shù)據(jù)的整理與統(tǒng)計分析
    4.5 結(jié)果
        4.5.1 一般觀察結(jié)果
        4.5.2 Beagle犬股骨頭標(biāo)本大體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
        4.5.3 Beagle犬股骨頭軟骨缺損修復(fù)標(biāo)本的組織學(xué)、Ⅱ型膠原免疫組化觀察結(jié)果
        4.5.4 Beagle犬股骨頭修復(fù)軟骨缺損區(qū)域標(biāo)本透射電鏡觀察結(jié)果
    4.6 討論
        4.6.1 種子細(xì)胞
        4.6.2 中藥提取物殼聚糖/海藻酸鈉膜支架作為細(xì)胞支架的優(yōu)勢及其作用.
        4.6.3 中藥提取物膜支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有機(jī)復(fù)合體修復(fù)軟骨缺損療效的分析
        4.6.4 動物模型的建立
        4.6.5 實驗的局限性
結(jié)語
參考文獻(xiàn)
附錄
在校期間發(fā)表論文情況
致謝
統(tǒng)計學(xué)審核證明


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于中醫(yī)藥文化推廣的實踐路徑研究——以貴陽中醫(yī)學(xué)院為例[J]. 王羿,武靜,王玉,石江梅.  貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2018(05)
[2]Efficacy of chitosan and sodium alginate scaffolds for repair of spinal cord injury in rats[J]. Zi-ang Yao,Feng-jia Chen,Hong-li Cui,Tong Lin,Na Guo,Hai-ge Wu.  Neural Regeneration Research. 2018(03)
[3]Mesenchymal stem cells for cartilage regeneration in osteoarthritis[J]. Baldur Kristjánsson,Sittisak Honsawek.  World Journal of Orthopedics. 2017(09)
[4]自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和同種異體肋軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)修復(fù)五指山小型豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究[J]. 楊程,倪江東,張壽,范忠誠.  中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2017(08)
[5]Systematic review on the use of autologous matrix-induced chondrogenesis for the repair of articular cartilage defects in patients[J]. Nafisa Shaikh,Matthew K T Seah,Wasim S Khan.  World Journal of Orthopedics. 2017(07)
[6]基于組織工程研究的可降解支架材料選擇策略[J]. 高慶東,祝旭龍,向俊西,呂毅,李建輝.  生物工程學(xué)報. 2016(02)
[7]應(yīng)用超順磁性氧化鐵粒子標(biāo)記組織工程關(guān)節(jié)軟骨種子細(xì)胞及在體磁共振示蹤的研究[J]. 金旭紅,楊柳,段小軍,謝兵,李忠,譚洪波.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2007(45)



本文編號：2971619