發(fā)布時間：2020-11-13 02:51

　　 第一部分:脫細胞骨軟骨基質(zhì)支架的制備及相關(guān)研究目的:制備多種兔脫細胞骨軟骨支架,并對這些支架進行脫細胞效果、成份、結(jié)構(gòu)與生物力學測試等研究,為組織工程構(gòu)造骨軟骨復(fù)合物建立基礎(chǔ)。方法:利用物理、化學、酶類聯(lián)合脫細胞方法,對兔股骨滑車關(guān)節(jié)和肋骨軟骨整體進行脫細胞處理,獲得整體骨軟骨支架,將兔股骨滑車關(guān)節(jié)和肋兩個部位骨軟骨按照透明軟骨、鈣化軟骨層、軟骨下骨三層結(jié)構(gòu)進行分離粉碎,對三層微粒進行脫細胞處理,重新交聯(lián)制備關(guān)節(jié)和肋來源的分層骨軟骨支架。對整體骨軟骨支架進行組織學染色,熒光比色法對整體支架各分層微粒進行殘留DNA含量測定,驗證脫細胞程度。利用氨基酸分析儀和熒光比色法對三層微粒中氨基酸和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)進行定量分析,XRD衍射儀對羥基磷灰石進行定量分析,并與天然骨軟骨進行對比。檢測三種支架密度、孔隙率、孔徑、吸水率等物理參數(shù),拉扭復(fù)合力學測試機檢測三種支架在干燥、濕潤狀態(tài)下的彈性極限、強度極限、彈性模量、脆性等力學機械性能,并和天然骨軟骨進行對比。結(jié)果:本方法脫細胞程度較為徹底。相比天然骨軟骨組織,脫細胞過程損失了約20~30%的氨基酸,損失了30~40%的GAG,但無機物并無損失。相比整體支架,分層支架的密度較小,孔隙率、孔徑、吸水率更大。相比天然骨軟骨組織,無論干燥或濕潤狀態(tài),兩種支架機械性能均差,且分層支架差距更大。結(jié)論:本研究聯(lián)合脫細胞效果較為徹底,但有機成分有所損失。脫細胞整體支架與分層支架相比天然組織,機械性能均有不同程度下降,提示結(jié)構(gòu)(尤其超微結(jié)構(gòu))和成份的完整性對生物力學性能影響至關(guān)重要。第二部分:脫細胞骨軟骨支架負載兔IPFP-SC的相關(guān)體外研究目的:分離提取兔髕下脂肪墊間充質(zhì)干細胞(IPFP-SC)并對之鑒定,檢測骨軟骨支架的生物相容性、細胞毒性,研究骨軟骨基質(zhì)成份、結(jié)構(gòu)對IPFP-SC向成骨、成軟骨分化的影響。初步探討利用脫細胞基質(zhì)進行生物3D打印。方法:利用膠原酶消化法和貼壁培養(yǎng)法分離提取出IPFP-SC,根據(jù)細胞表面分子流式細胞分析(FACS)、免疫熒光(IF)鑒定表型,檢測其成骨、成軟骨、成脂分化能力。制作兔膝OA模型,比較健康與OA兔IPFP-SC在增殖、遷移、成軟骨方面的區(qū)別。利用直接接種法、直接植入法、浸提液培養(yǎng)法驗證多種脫細胞骨軟骨支架的生物相容性與細胞毒性。檢測支架骨、軟骨的仿生結(jié)構(gòu)和骨、軟骨組織成份對IPFP-SC向成骨、成軟骨方向誘導(dǎo)的作用。利用Micro-CT掃描和天狼星染色連續(xù)切面圖像數(shù)字化方式,獲得兔天然骨軟骨的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),制作STL格式文件,對利用脫細胞基質(zhì)生物3D打印進行初步探討。結(jié)果:所提取細胞,FACS及IF驗證表達CD73+、CD90+、CD105+、CD 44+、CD34-、CD45-、HLADR-,可向成骨、成軟骨、成脂分化。OA個體IPFP-SC相比健康個體,在增殖方面無顯著差別,遷移及成軟骨能力較弱。三種脫細胞支架生物相容性良好,無細胞毒性。骨軟骨的結(jié)構(gòu)、成份均可促進IPFP-SC向成骨、成軟骨方向分化。得到的骨軟骨結(jié)構(gòu)STL文件可以較好的模擬打印出天然組織。結(jié)論:所提取細胞證實為間充質(zhì)干細胞,OA個體IPFP-SC遷移及成軟骨能力較弱可能是影響軟骨修復(fù)的原因。脫細胞支架的仿生結(jié)構(gòu)和組成成份均影響著IPFP-SC向成骨、成軟骨分化,這為IPFP-SC體內(nèi)誘導(dǎo)為目的細胞打下了基礎(chǔ)第三部分:脫細胞骨軟骨支架負載兔IPFP-SC修復(fù)兔骨軟骨缺損目的:通過將負載IPFP-SC的三種脫細胞骨軟骨支架復(fù)合體植入兔股骨滑車骨軟骨缺損模型中,研究三種組織工程方法修復(fù)骨軟骨缺損的效果。方法:制作42例標準兔股骨滑車關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型。分別將脫細胞關(guān)節(jié)整體骨軟骨支架、脫細胞關(guān)節(jié)分層骨軟骨支架、脫細胞肋分層骨軟骨支架三種支架分為3組,組內(nèi)分為負載或不負載IPFP-SC的亞組,除空白組共6小組,隨機分配植入骨缺損模型中。術(shù)后1個月、3個月、6個月處死實驗兔取得標本,大體觀察修復(fù)組織的軟骨面及軟骨下骨面,石蠟切片進行HE、天狼猩紅、番紅固綠、甲苯胺藍染色,比較各種組織工程方法修復(fù)骨軟骨損傷的效果。結(jié)果:總體修復(fù)效果,負載IPFP-SC組優(yōu)于單純支架組,空白組最差,軟骨修復(fù)方面,分層支架組優(yōu)于整體支架組,軟骨下骨修復(fù)方面則相反。1月時,除空白組外,各組間差異不大,3月、6月時,包括空白組,各組差異最明顯。結(jié)論:三種組織工程構(gòu)造方式對骨軟骨缺損均能起到一定的修復(fù)作用,其中分層支架修復(fù)軟骨能力較強,整體支架修復(fù)軟骨下骨能力較強。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

圖 1-1：兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)骨軟骨整體取出術(shù)（A.兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口及劃線示意圖；B.切開皮膚及皮下；C.注意避開關(guān)節(jié)囊內(nèi)側(cè)血管及其分支；D.進入關(guān)節(jié)囊內(nèi)；E.暴露股骨滑車部分；F.環(huán)鉆鉆取滑車中部骨軟骨）

圖 1-1：兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)骨軟骨整體取出術(shù)關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口及劃線示意圖；B.切開皮膚及皮下；C.注意避開關(guān)節(jié)囊內(nèi)側(cè)血管及其分D.進入關(guān)節(jié)囊內(nèi)；E.暴露股骨滑車部分；F.環(huán)鉆鉆取滑車中部骨軟骨）

圖 1-3：兔關(guān)節(jié)骨軟骨和肋骨軟骨整體脫細胞流程圖（2）關(guān)節(jié)和肋骨軟骨三層微粒的脫細胞處理由于分層制作的組織顆粒對外形要求并不嚴格，將健康兔麻醉過量處死后，無菌取出兔股骨滑車、髁部關(guān)節(jié)骨軟骨和 1~10 肋骨軟骨，放入生理鹽水備用。按以下處理流程（圖 1-4）對兔關(guān)節(jié)和肋骨軟骨進行三層結(jié)構(gòu)微粒的脫細胞處理。①將切取的骨軟骨去除附著的其他組織，去離子水反復(fù)沖洗 5 遍直至清亮。切削表面 HC，當切削時感覺從彈性及韌性慢慢變堅硬，觀察切面顏色變黃，此為 CC，繼續(xù)切削 CC，直至發(fā)現(xiàn)有血樣組織，此時切削有磨砂感，此為 SB；切除肋骨骨皮質(zhì)及骨膜、軟骨膜，此時 HC 和 CC 輕輕震蕩即可脫離，將肉眼可見的 CC 切下即可。將三層結(jié)構(gòu)分別取下后，切碎至 2mm×2mm×2mm 大小。② 將組織微粒置于去離子水浸泡至完全淹沒，放置于-80℃冷凍 8 h 后取出，放置于 37℃烘箱下完全融化后，再放置于超聲清洗機內(nèi)，超聲功率 100%，溫度 20℃，時間 20 min，超聲清洗完畢后，再次以去離子水沖洗 3 遍直至液體清亮。以上步驟反復(fù) 3 次。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 徐銘恩;;生物3D打印——打印生命的希望[J];杭州科技;2013年05期

2 卓大宏;;世界衛(wèi)生組織公布第二個“骨關(guān)節(jié)10年(2010~2020)”——促進肌骨關(guān)節(jié)健康,讓人們可以恒動而不衰[J];中國矯形外科雜志;2011年16期

本文編號：2881613