皮膚由表皮、真皮和皮下組織構成,是人體對抗外部環(huán)境的一層天然保護屏障。當皮膚遭到機械損傷、化學品危害以及細菌真菌侵入時,人體就會失去這層保護屏障,機體也會啟動應激反應促進皮膚功能恢復。針對不規(guī)則、大面積以及深淺不一的皮膚創(chuàng)傷,目前的主要治療策略為采用網(wǎng)狀移植或者組織工程產(chǎn)品的異體或異種脫細胞基質(zhì)敷料進行移植,其具有較低的免疫原性和良好的組織相容性,機械性與正常皮膚極其相近,是理想的生物輔料,但敷料與深淺不一的損傷部位貼合性不佳,容易造成空腔,使得并發(fā)癥的發(fā)生率提高。因此,本課題中,我們通過一種創(chuàng)新的細胞噴灑裝置,用于進行細胞噴霧移植促進損傷后的表皮再生,形成一種特殊形式的組織工程皮膚。結合交叉學科優(yōu)勢,自主研發(fā)同時可以裝載自體皮膚細胞和脫細胞豬皮基質(zhì)粉的噴灑裝置用于皮膚創(chuàng)傷治療。探討細胞噴灑系統(tǒng)作為組織工程產(chǎn)品對皮膚損傷修復的意義。因此,本課題可分解為三個部分。第一部分中,我們重點評估了細胞噴灑裝置對于細胞的影響,驗證了皮膚噴槍的優(yōu)勢與可應用性;第二部分重點在于通過建立一種溫和、高效的原代表皮干細胞(human keratinocytes stem cells,hKSCs)分離方法,構建足以使體外規(guī)模化擴增的三維培養(yǎng)方案,提供足夠數(shù)量的種子細胞;第三部分,通過體外生物酶解和冷凍機械研磨方法,獲得高純度且保留生物活性的脫細胞豬皮細胞外基質(zhì)粉末(Decellular porcine skin extracellular matrix powder,ECMP)制備,作為細胞移植的液體載體促進表皮細胞和成纖維細胞參與損傷修復,同時探索ECMP對表皮和成纖維細胞生長的支持作用及兩者對皮膚創(chuàng)傷修復的促進作用。1.細胞搭載噴槍的生物學檢測我們設計不同類型細胞裝載噴灑,證明噴灑過程對于細胞數(shù)量、分布和活性并沒有影響,噴灑過程對細胞功能執(zhí)行不會產(chǎn)生影響。確定了噴灑裝置通過Live/Dead染色以及免疫熒光等結果可以發(fā)現(xiàn),噴灑裝置可以實現(xiàn)霧化效果,液滴均勻化分布;噴灑后液滴內(nèi)的細胞具有高活性,并隨著霧化效果同樣均勻分布。對不同細胞類型與不同濃度的細胞外基質(zhì)重懸到一起后裝載噴灑后,結果顯示,細胞可以快速粘附并伸展。2.表皮干細胞作為種子細胞儲備我們摸索創(chuàng)新了快速、溫和酶組合的消化方法,可以得到具有高活性的表皮干細胞。建立了一種對表皮干細胞進行無滋養(yǎng)層、無血清的三維培養(yǎng)體系,結果表明,體外擴增6代以內(nèi)的倍增時間穩(wěn)定維持在52小時左右,為后期進入臨床的細胞移植得到足夠數(shù)量的表皮細胞。這樣培養(yǎng)方式下擴增起來的表皮干細胞活力狀態(tài)非常好,通過透射電鏡結果可以清楚看到分泌小泡,以及大量形成了具有表皮特有的橋粒連接。組織學結果檢測發(fā)現(xiàn),細胞球高表達再生相關蛋白K14、增殖蛋白P63、Ki67以及上皮細胞連接E-cad、Claudin1。對表皮干細胞體外長期培養(yǎng)鑒定發(fā)現(xiàn),細胞裝載噴灑后可以在體外形成假復層;經(jīng)鑒定,復層的最下面一層細胞高表達再生標志蛋白ITGA6、K14,說明了噴灑后的細胞在體外非常好地執(zhí)行增殖分化功能。在NOD/SCID全免疫缺陷小鼠的背部建立全層切除皮膚傷口模型,損傷后將富含表皮干細胞的細胞聚集體裝載皮膚噴槍并均勻噴灑于創(chuàng)面局部,移植治療后觀察細胞在傷口處的歸巢和整合。NOD/SCID小鼠的體內(nèi)移植實驗證明,分離培養(yǎng)的人表皮干細胞噴灑傷口后,在第7天與對照組相比就開始明顯快速恢復,證明移植的細胞具有高活性并在體外存活時間長,分泌刺激傷口加速愈合。3.脫細胞真皮基質(zhì)搭載噴灑裝置促表皮和成纖維細胞參與創(chuàng)傷修復經(jīng)過生物酶法脫細胞、冷凍干燥后-80℃保存?zhèn)溆?經(jīng)過不同冷凍研磨程序得到ECMP,再由鉆-60輻照獲得無菌基質(zhì)粉;通過觀察ECMP顆粒分布特性,確定適合應用的冰凍研磨程序;通過研究不同濃度ECMP對細胞的促黏附作用,確定ECMP的使用濃度范圍;通過檢測ECMP對成纖維細胞的促遷移和對表皮細胞的促增殖作用,證實ECMP對創(chuàng)傷修復的重要作用;通過免疫熒光檢測細胞表面成熟與分化蛋白的表達,分析在與ECMP共培養(yǎng)時,原代表皮角質(zhì)細胞成熟及干性維持的水平。以上實驗數(shù)據(jù)表明本課題所使用的噴灑裝置,在噴灑后對細胞生物學功能的影響做了全面細致的研究,驗證了噴灑過程不僅對細胞的活力無影響,對細胞在體外增殖、分化和遷移等功能的發(fā)揮也無影響。確保了建立的細胞移植系統(tǒng)順利使用推廣。對分離培養(yǎng)獲得的表皮干細胞(hKSCs)的生物學特性進行鑒定表明細胞在體外同樣具有擴增潛能,為規(guī)模化擴增奠定基礎。同時,做到了完善的無血清、無滋養(yǎng)層的三維培養(yǎng)條件;使用臨床級別Knockout SR作為血清替代物,穩(wěn)定獲得功能完善的細胞。細胞外基質(zhì)在傷口恢復過程中可以最大限度的保留細胞培養(yǎng)時分泌的各種營養(yǎng)因子隨著細胞增殖遷移,創(chuàng)面再表皮化加速。本課題摸索建立后發(fā)現(xiàn),在冷凍研磨程序7次循環(huán)下,獲得的ECMP粒徑均小于15μm,可達到應用的要求,ECMP以500 μg/cm2濃度包被培養(yǎng)板,能夠顯著促進成纖維細胞的遷移,并且促進表皮細胞增殖并維持其干性。
【學位單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R318
【部分圖文】：

實驗結果??１．噴灑裝置噴灑性能檢測??前言提到了通過皮膚組織工程進行創(chuàng)傷修復，具體設計如圖１－１，表皮單位??的體外擴增后，重懸在細胞外基質(zhì)（ＥＣＭ）裝載皮膚噴槍，電動方式噴灑并完??全覆蓋住不規(guī)則創(chuàng)傷面，填充不同深度的組織中。ＥＣＭ促細胞活力，提供支撐，??創(chuàng)造細胞快速遷移以及加速信號傳遞微環(huán)境。ＥＣＭ的存在最大的優(yōu)勢是在傷口??恢復過程中可以最大限度的保留細胞培養(yǎng)時分泌的各種營養(yǎng)因子隨著細胞增殖??遷移，創(chuàng)面再表皮化完全。??．?ｊ?．皮槍?．．．．表皮單位＋ＥＣＭ??電也：便攜性?＿??１Ｊ?Ｖ??惠?ＴＯｅｃｍ??「１?椒?ｆ—?１—＾??＇不規(guī)則創(chuàng)面??＊＊?—??抆杈單怔?ｙ?瑯懸細胞＋ＥＣＭ?ｔｆ殯分化的細胞群??增殖、遷移和分化??、????圖１－１建立一種新型靈活的細胞移植系統(tǒng)用于創(chuàng)傷修復??噴灑的液滴尺寸是衡量噴灑設備性能的一個重要因素，與注射器（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）??相比較，分別噴灑ＰＢＳ溶液、ＨａＣａＴ細胞懸液，在顯微鏡下觀察液滴粒徑、細??胞分布。從圖１－２的結果可以看到噴槍的液滴直徑在５０＃ｎ左右，大小一致、細??第１０貞??

－??ＢＨＫ??圖１－２噴灑液滴霧化效果、均勻程度的對比??上面兩張為明場下噴槍（Ｓｐｒａｙ）和注射器（Ｉｎｊｅｃｔｏｒ）噴灑ＰＢＳ的液滴大小，標尺為ｌｍｎｉ：??下圖為ＨａＣａＴ細胞系用ＤＡＰＩ染核之后分別噴灑的熒光圖。??對噴槍性能檢驗的另一因素是噴灑范圍與均勻度的關系，ＨａＣａＴ細胞用??Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色Ｊｒｉ裝載噴槍垂直噴灑，如圖１－３所示ａ、ｂ、ｃ三個［Ｘ域內(nèi)細胞數(shù)??相差不人，ｉｌＥ明細胞的分布具Ｗ很好的均勻性。??ａ?ｂ?ｃ?ａ：?０－２?ｃｍ??＜?￣?ｍ?？?ｂ：?２－４?ｃｎｉ??ｃ：?４－６?ｃｍ??■■■??圖１－３噴灑范圍內(nèi)細胞的均勻分布熒光圖??第１１貞??

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【參考文獻】

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1 Abu Bakar Mohd Hilmi;Ahmad Sukari Halim;;Vital roles of stem cells and biomaterials in skin tissue engineering[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

本文編號：2873993