目前,癌癥已成為我國居民死亡的主要原因之一,是嚴重危害我國居民健康的重大公共衛(wèi)生問題。近年來,隨著個體化醫(yī)療的不斷發(fā)展,根據(jù)腫瘤患者的基因突變信息為患者制定個性化治療方案的“精準醫(yī)學”模式在臨床腫瘤患者的治療當中發(fā)揮著日益重要的作用。大量的腫瘤基因突變在癌癥患者的診斷、治療及預(yù)后判斷中的臨床應(yīng)用價值已被證實。由于越來越多的腫瘤基因突變位點不斷被發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)的單個位點的基因檢測方法已不能滿足臨床需求。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn),使得多個基因的多個位點同時檢測成為可能。高通量測序較傳統(tǒng)的分子檢測方法要復雜得多,既包括核酸提取、序列靶向富集、文庫制備和測序等含多個實驗步驟的“濕實驗”過程,還有包含測序后的數(shù)據(jù)質(zhì)量分析、參考序列比對、變異識別、注釋和結(jié)果報告解讀等步驟的生物信息學分析流程(即“干實驗”過程),生物信息學分析流程對于高通量測序檢測結(jié)果的準確性與“濕實驗”一樣具有決定性意義。對于臨床高通量測序檢測的生物信息學分析,要想獲得準確可靠的生物信息學分析結(jié)果,就需要選擇合適的參考物質(zhì)(Reference material,RM),也稱為參考數(shù)據(jù)(Reference dataset)對生物信息學分析流程進行優(yōu)化、性能確認、室內(nèi)質(zhì)量控制(Internal Quality Control,IQC)以及定期開展室間質(zhì)量評價(External Quality Assessment,EQA)。通過使用臨床樣本或腫瘤細胞系DNA等制備的參考數(shù)據(jù)雖然可以用于生物信息學分析流程的優(yōu)化、性能確認、室內(nèi)質(zhì)量控制及室間質(zhì)量評價,但其制備較為繁瑣,成本較高,且無法包含所有的突變類型�；跍y序數(shù)據(jù)編輯的計算機模擬方法制備的生物信息分析參考數(shù)據(jù),具有制備簡單、快速、成本低且不受突變類型的限制等優(yōu)點。但目前已有的基于測序數(shù)據(jù)編輯的生物信息學分析參考數(shù)據(jù)模擬軟件BAMSurgeon僅能對單核苷酸變異及短片段插入/缺失變異有較好的模擬效果,而不能模擬拷貝數(shù)變異、多核苷酸變異等復雜變異,并且不能對靶向測序數(shù)據(jù)的大片段結(jié)構(gòu)變異進行模擬。此外,BAMSurgeon也不能對Ion Torrent測序平臺的數(shù)據(jù)進行模擬。因此,缺少合適的生物信息學分析參考數(shù)據(jù)對不同臨床實驗室的生物信息學分析流程進行全面的性能評估。本研究中,我們開發(fā)了一款基于測序數(shù)據(jù)編輯的生物信息學分析參考數(shù)據(jù)模擬軟件——VarBen。為驗證VarBen軟件制備的體細胞突變生物信息學分析參考數(shù)據(jù)是否可以模擬真實腫瘤樣本中的體細胞突變,我們將含有真實體細胞突變的腫瘤樣本測序數(shù)據(jù)與VarBen和BAMSurgeon軟件制備的體細胞突變生物信息學分析參考數(shù)據(jù)進行了比較。結(jié)果表明,相比于BAMSurgeon,VarBen模擬體細胞突變的檢出效果與腫瘤樣本測序數(shù)據(jù)中真實體細胞突變(MB gold set)的檢出效果更加相近,這一結(jié)果證明VarBen制備的生物信息學分析參考數(shù)據(jù)可模擬出接近真實腫瘤樣本測序數(shù)據(jù)的體細胞突變。同時為驗證VarBen軟件的可靠性和穩(wěn)定性,我們評估了原始測序數(shù)據(jù)基因組背景、比對軟件的使用以及測序reads分割是否會對VarBen產(chǎn)生影響。結(jié)果證明原始測序數(shù)據(jù)的基因組背景、使用的比對軟件以及原始測序reads分割不會對VarBen軟件體細胞突變的模擬產(chǎn)生影響。綜上,我們的驗證實驗證明了 VarBen軟件的可靠性和穩(wěn)定性,且其制備的模擬測序數(shù)據(jù)可用作臨床體細胞突變檢測生物信息學分析參考數(shù)據(jù)。為全面評估臨床實驗室腫瘤體細胞突變生物信息分析能力,我們使用VarBen制備的生物信息學分析參考數(shù)據(jù)開展了腫瘤體細胞基因突變高通量測序檢測生物信息學分析室間質(zhì)量評價調(diào)研活動。我們共收到實驗室提交的113個有效分析結(jié)果,實驗室提交結(jié)果統(tǒng)計分析顯示,相對于單核苷酸變異,目前臨床實驗室對短片段插入/缺失變異的生物信息學分析能力還有待提高,尤其是復雜插入-缺失變異和FLT基因內(nèi)部串聯(lián)重復(internal tandem duplication,ITD)。實驗室在建立高通量測序基因突變檢測生物信息學分析流程的過程中,需充分重視對生物信息學分析流程的性能確認,以保證分析結(jié)果的準確性。此外,本次室間質(zhì)評也證明了 VarBen制備生物信息學分析參考數(shù)據(jù)的實用性。綜上所述,本研究開發(fā)了一款基于測序數(shù)據(jù)編輯的生物信息學分析參考數(shù)據(jù)模擬軟件—VarBen。與目前已有模擬軟件相比,VarBen解決了目前無法對拷貝數(shù)變異、多核苷酸變異、復雜插入-缺失變異等復雜變異以及靶向測序數(shù)據(jù)的大片段結(jié)構(gòu)變異進行模擬的難題,且同時適用于Illumina測序平臺、華大BGI測序平臺和Ion torrent測序平臺�；跍y序數(shù)據(jù)編輯的方法可保留高通量測序“濕實驗”部分文庫制備及上機測序過程中產(chǎn)生的背景錯誤分布模式,從而保證模擬數(shù)據(jù)更加的接近臨床真實測序數(shù)據(jù),同時可對任意類型的突變位點進行模擬,具有制備成本低、快速、可靠等優(yōu)點。通過使用VarBen制備個性化的生物信息學分析參考數(shù)據(jù)可幫助臨床實驗室發(fā)現(xiàn)其生物信息學分析流程中存在的問題,從而幫助臨床實驗室提高基因突變檢測的準確性。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q811.4;R730.5
【部分圖文】：

“Ｇ”四個堿基的流動順序即可計算出ＤＮＡ的堿基序列信息。雖然各個平臺??都有自己不同的測序原理，但其測序的基本流程比較相近，根據(jù)實驗流程的不同，??高通量測序基因檢測主要分為兩個部分（圖１）：?１）實驗操作部分，又稱為“濕實驗”??（ｗｅｔ－ｂｅｎｃｈ?ｐａｒｔ?ｏｆ?ＮＧＳ?）；包括樣本的米集、ＤＮＡ的提取、加入分子標簽（ｂａｒｃｏｄｅ?）、??目標區(qū)域靶向富集（基于ＰＣＲ的擴增子靶向捕獲技術(shù)或基于核酸雜交的探針捕獲??技術(shù)）、測序文庫制備、上機測序、測序數(shù)據(jù)的生成。２）生物信息學分析部分，該??過程又稱為？？干實驗”（ｄｒｙ－ｂｅｎｃｈ?ｐａｒｔ?ｏｆ?ＮＧＳ）；通過高性能的計算機和不同的生物??信息分析軟件的組合建立生物信息分析流程（Ｂｉｏｉｎｆｏｍｉａｔｉｃｓ?ｐｉｐｅｌｉｎｅ?），主要步驟包??括：原始數(shù)據(jù)質(zhì)控、參考序列比對、變異識別、注釋和臨床報告解讀等。??腫瘤組織標本?正常配對樣本??????－１??■Ｉ?＿??Ｓａｍｐｌｅ?ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ?汽?ｉ甬暈測序??ｒ…—．＇

ｇ．ｏｗ?ｃａｏｕｍｏｒ?ｇｅｎｏｍｅ?ｓｍｕａｏｎｙａｒｅｎ??根據(jù)目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，測序數(shù)據(jù)編輯（Ｒｅａｄｓｅｄｉｔｉｎｇ）策略是目前模擬臨床??生物信息學分析流程參考數(shù)據(jù)的最佳方案。因此，我們選取了測序數(shù)據(jù)編輯策略并??確定了測序數(shù)據(jù)的編輯流程（圖３）：??１）首先將測序完成后的原始測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組，獲得比對后的測序??數(shù)據(jù)（ＢＡＭ文件），經(jīng)過參考基因組比對完成之后的每一條ｒｅａｄ可獲得其??在參考基因組上的坐標信息。??２）提供一個需要模擬的突變列表，根據(jù)提供的突變列表信息將需要進行編輯??的ｒｅａｄｓ挑選出來。突變列表包含的信息主要包括：突變位點的位置（染色??體起始和終止位點）、目標突變頻率、突變類型以及突變的堿基。??３）根據(jù)突變列表提供的突變類型、突變頻率以及突變的堿基類型對選取的??ｒｅａｄｓ進行相應(yīng)的編輯。??４）將編輯后的測序ｒｅａｄｓ重新比對到參考基因組以獲取編輯之后正確的比對信??息，隨后與未編輯的原始測序ｒｅａｄｓ進行合并，最終得到含有特定突變位點??的模擬腫瘤測序樣本。??

Ａｌｔ??ｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ?？?Ａｌｔ．?■丨■—?＾??串聯(lián)重復?倒位??Ｅ?Ｆ??Ｒｅｆ．?ｅｚ￥－￣？?－．?ｍｍ?？?Ｒｅｆ．?ｍｚｍ－?？??？??Ａｌｔ．??ｍｒｍ￣—？?—￣ｍｚｍ?？?Ａｌｔ．??ｍｒｍ?？?一￣＿：ｊｉ?？??平衡易位?非平衡易位??Ｇ??染色體全臂易位??圖６結(jié)構(gòu)變異的不同類型??Ｆｉｇ．?６?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｙｐｅｓ?ｏｆ?ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｖａｒｉａｎｔｓ??Ａ：大片段缺失；Ｂ：外源ＤＮＡ插入；Ｃ：串聯(lián)重復；Ｄ：倒位；Ｅ：平衡易位；??Ｆ：非平衡易位；Ｇ：染色體全臂易位??
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本文編號：2870621