目的探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)在短肽水凝膠中的生長狀況、增殖能力、干性基因表達(dá)及成骨分化研究。方法1)對水凝膠RGD(Ac N-RADARADARADARADA-GG-RGDSP-CONH2),TTS(Ac N-RADARADARADARADA-GG-TTSWSQ-CONH2),FOG(Ac N-RADA RADARADARADA-GG-FOGER-CONH2)分別采用透射電鏡、圓二色光譜和流變學(xué)分析行表征檢測;1%上述3種肽依次分別與1%RADA16按3:7、3:7及2:8混合得到RAD/RGD、RAD/TTS及RAD/FOG,超聲并4℃保存。2)采用兩酶分步消化法分離h AMSCs,并行貼壁培養(yǎng)、純化細(xì)胞至P3代,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、細(xì)胞形態(tài)學(xué)及定向誘導(dǎo)分化對h AMSCs進(jìn)行鑒定;將h AMSCs培養(yǎng)至P3代,用于后續(xù)與自組裝短肽水凝膠共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。3)實(shí)驗(yàn)分為5組:2D組(2D Group,2D)、G1組(純RADA16)、G2(RAD/RGD,RADA16:RGD=3:7)、G3組(RAD/TTS,RADA16:TTS=3:7)及G4組(RAD/FOG,RADA16:FOG=2:8);建立h AMSCs與G1、G2、G3及G4組水凝膠細(xì)胞支架復(fù)合體以及二維對照組模型,倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài);采用Live/Dead檢測細(xì)胞在支架中的存活情況;CCK-8和Ed U檢測細(xì)胞在支架中的增殖活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期情況;隨后運(yùn)用茜素紅染色評估成骨分化效應(yīng);采用q PCR對比分析h AMSCs于水凝膠及2D環(huán)境中培養(yǎng)第8天時干性基因Nanog、Oct-4a和Rex-1的m RNA表達(dá)情況,并探討Runx2、Osx、BSP、ALP、Col1α1和Ocn基因的7天、14天、21天成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果1)圓二色譜檢測和透射電鏡發(fā)現(xiàn)RGD、TTS和FOG三種自組裝短肽在溶液中均可形成β-折疊的二級結(jié)構(gòu),并最終形成寬約7nm,長幾百μm的納米纖維;流變學(xué)檢測顯示,儲能模量(G′)大于損耗模量(G″),表明它們能夠形成水凝膠。RADA16分別與上述3種水凝膠混合后能快速自組裝成均質(zhì)、透明及彈性外形的水凝膠。2)h AMSCs傳代至第3代,細(xì)胞具有呈長索狀、螺旋狀生長的典型間充質(zhì)形態(tài);h AMSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105及波形蛋白,不表達(dá)或低表CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR;茜素紅染色顯示,成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞存在礦化結(jié)節(jié);經(jīng)油紅O染色,成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴聚集;甲苯胺藍(lán)染色顯示,成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞基質(zhì)中分泌大量的糖胺聚糖。3)h AMSCs在各組水凝膠支架中80%以上存活且均勻分散生長;CCK-8和Ed U實(shí)驗(yàn)檢測顯示h AMSCs在3D條件下較2D培養(yǎng)增殖較慢,可能與h AMSCs在水凝膠中處于靜息狀態(tài)有關(guān),隨后行細(xì)胞周期進(jìn)一步驗(yàn)證,h AMSCs于水凝膠中70%以上處于G0/G1期,而處于S期細(xì)胞較少(21%左右),Ed U數(shù)據(jù)顯示增殖能力G1G2G3G4與細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)處于S期細(xì)胞百分率數(shù)據(jù)相吻合;與2D相比,水凝膠促進(jìn)干性基因Nanog、Oct-4a、Rex-1及成骨分化基因Runx2、Osx、BSP、ALP、Ocn和Col1α1的m RNA表達(dá)。結(jié)論1)h AMSCs體外擴(kuò)增培養(yǎng)后接種到水凝膠中,與2D培養(yǎng)環(huán)境相比,細(xì)胞增殖減慢。2)h AMSCs接種到水凝膠中培養(yǎng)第8天行實(shí)時熒光定量PCR檢測,與2D培養(yǎng)條件相比,干細(xì)胞的干性基因m RNA表達(dá)量上調(diào)。3)在一定成骨誘導(dǎo)后,自組裝短肽支架成骨分化基因的m RNA表達(dá)量上調(diào)。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318
【部分圖文】：

RGD、TTS 及 FOG 稀釋成 0.05%，取 10 μL 稀釋 1％的磷鎢酸負(fù)染后，抽真空待其干燥后使用透學(xué)分析RGD、TTS 及 FOG 稀釋成 0.5%，混合均勻后，每中央。在室溫、應(yīng)變?yōu)?0.5％、恒定 1HZ 頻率的儲掃描參數(shù)檢測。維凝膠形成觀察RGD、TTS、FOG 均可在一定時間內(nèi)自組裝成均 1.1 括號部分）。

圖 1.2 自組裝短肽 CD 光譜。Fig 1.2 CD examination of 0.01% of self-assembling peptides in (A) aqueous solution and (B) 50mM PBS (pH7.2).2.3 透射電子顯微鏡結(jié)果圖 1.3 的 TEM 結(jié)果顯示，水凝膠 RGD、TTS 及 FOG 溶液經(jīng) 1%磷鎢酸負(fù)染后，均能自組裝成相互交聯(lián)的納米網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，納米支架孔徑約為 5-200nm，直徑約 8-10 nm 不等。

圖 1.2 自組裝短肽 CD 光譜。Fig 1.2 CD examination of 0.01% of self-assembling peptides in (A) aqueous solution and (B) 50mM PBS (pH7.2).2.3 透射電子顯微鏡結(jié)果圖 1.3 的 TEM 結(jié)果顯示，水凝膠 RGD、TTS 及 FOG 溶液經(jīng) 1%磷鎢酸負(fù)染后，均能自組裝成相互交聯(lián)的納米網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，納米支架孔徑約為 5-200nm，直徑約 8-10 nm 不等。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Christina McKee;Mick Perez-Cruet;Ferman Chavez;G Rasul Chaudhry;;Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年07期

2 Sufang Han;Yannan Zhao;Zhifeng Xiao;Jin Han;Bing Chen;Lei Chen;Jianwu Dai;;The Three-Dimensional Collagen Scaffold Improves the Sternness of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells[J];遺傳學(xué)報;2012年12期

本文編號：2867560