組織工程技術(shù)的發(fā)展為器官移植供體短缺提供了潛在的解決方案。細胞片技術(shù)是“自下而上”組織工程學(xué)策略的重要組成部分,在細胞無損收割、薄層組織替代治療及細胞密集型三維組織構(gòu)建中具有重要價值。然而如肌肉、骨骼、血管和神經(jīng)等組織,其生理功能的實現(xiàn)與細胞及細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序性密切相關(guān)因此,為了更好地構(gòu)建功能化仿生組織,需要獲得細胞及細胞外基質(zhì)方向可控的細胞片,并開發(fā)有效的細胞片轉(zhuǎn)移操控系統(tǒng)。光控細胞片技術(shù)利用TiO_2光響應(yīng)特點可以高效無損地收割細胞片,本文以光控細胞片技術(shù)為基礎(chǔ),構(gòu)建了功能一體化的光控細胞片操控體系,包括光控細胞排列、光控細胞片脫附、光敏凝膠輔助細胞片轉(zhuǎn)移和疊加等,并對其生物學(xué)性能及機制進行了研究。首先我們論證了TiO_2納米點薄膜具有光照功能化特征,即合適的紫外光預(yù)處理可以提高納米點的生物活性,促進蛋白及細胞粘附。而掩膜版下光照處理則得到了微圖案化的生物活化區(qū)域,細胞在微圖案化表面表現(xiàn)出定向伸展和有序排列的行為。通過對光照處理后的樣品表面分析,明確了光生表面羥基介導(dǎo)了這一生物活化過程,即光照局部端羥基比例增加吸引了更多基質(zhì)蛋白的沉積,并最終影響了細胞粘附和伸展的行為。據(jù)我們所知,這是首次將TiO_2光照功能化現(xiàn)象應(yīng)用于細胞微圖案化調(diào)控。將定向排列的細胞繼續(xù)培養(yǎng)至完全匯合,其方向性被保存了下來,再次紫外光處理,由于基板表面的親水性改變及光生羥基作用,外層蛋白與基板脫離,可以獲得包含部分外層蛋白的定向細胞片。實驗證實,通過該方式收割的定向細胞片具有良好的生物活性和統(tǒng)一的方向性。我們分析了細胞感受光控微圖案化表面的機制,以進一步認識和優(yōu)化光控細胞定向技術(shù)。本研究引入了“快速傅里葉變換”的圖像處理方法來獲取細胞排列的定量化數(shù)據(jù)。通過分析微圖案化表面的幾何參數(shù)與細胞排列之間的關(guān)系,明確了細胞與條帶之間的尺寸關(guān)系是影響細胞定向排列的重要因素,并基于此獲得了更多細胞類型的定向細胞片。進而從單個細胞層面觀察了微圖案化表面細胞的粘附和伸展情況,明確偽足在細胞感受外周環(huán)境中的重要作用。通過抑制細胞骨架相關(guān)蛋白及通路,我們認為MyosinⅡ/ROCK通路介導(dǎo)的細胞偽足回縮,是實現(xiàn)光控微圖案化表面定向排列的重要機制。由于直接脫附的定向細胞片操控性較差,而獨特的收縮特性也限制了其進一步應(yīng)用,我們將光聚合水凝膠GelMA整合到光控細胞片脫附、轉(zhuǎn)移和疊加過程中。實驗證明,在GelMA的輔助下,定向細胞片脫附效率增加,脫附的細胞片可長期保養(yǎng)于體外,并分泌具有方向性的細胞外基質(zhì),并可以影響與之共培養(yǎng)的其他細胞。在脫附的定向HFF-1細胞片表面定植HUVECs,后者不僅呈現(xiàn)方向性排列,同時形成了更好的微血管結(jié)構(gòu),我們認為這與HFF-1定向細胞片表達了更高水平的成血管方面基因VEGFA和ANG-1有關(guān)。最后,GelMA還可以操控不同方向的定向細胞片疊加,構(gòu)建具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的三維組織。GelMA輔助系統(tǒng)的引入使光控細胞片技術(shù)真正成為了功能整合的有機整體,為其更大的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318
【部分圖文】：

是由材料表面的化學(xué)組成引起的。Ｔｉ０２表面缺陷容易吸附環(huán)境中的水分子形成表??面羥基［９Ｑ］，因此，我們對光照前后樣品進行了表面羥基構(gòu)成的分析及比較。通過??對氧的ＸＰＳ結(jié)果進行分峰分析，如圖３．１Ｃ和Ｄ所示，其中５３２．２ｅＶ附近的峰屬??于端羥基Ｔｉ－ＯＨ中的氧，即為表面羥基中的氧；位于５３１．０ｅＶ附近的峰為橋羥基??ＴｉＯＨ中的氧，而靠近５２９．４?ｅＶ附近的峰則為Ｔｉ０２中的氧，即Ｔｉ－Ｏ－Ｔｉ［９０，９１］。對上??述各峰面積進行積分，總和記為氧總量，而各峰面積同氧總量的比即各個狀態(tài)氧??的比例分布，如表３．１，可以看到光照處理后，樣品中表面羥基所占比例增加了約??５％。結(jié)果與我們的推斷一致，即Ｔｉ０２納米點光照親水性的改變與光生羥基的作用??有關(guān)。由于在常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境中，溶液的ｐＨ值常大于羥基等電點，光照處理后的樣??品具有更多的表面羥基，因此帶有更多負電荷，更易吸引蛋白中帶正電的氨基，??同時材料表面的羥基使吸附蛋白構(gòu)型發(fā)生變化

我們從潤濕性，蛋白粘附和細胞粘附三個層面來驗證這一假設(shè)。??由于圖案化的潤濕效果不易以接觸角的結(jié)果顯示，我們選擇采用水蒸汽凝結(jié)??實驗［９２］反映潤濕性效果。圖３．２Ａ顯示在未照射組，水蒸汽以水滴的形式分散地凝??結(jié)于樣品表面，而經(jīng)過紫外輻照處理后的樣品，由于親水性增加，水珠可以迅速??的鋪展至整個樣品表面。在掩膜版光照組，水珠則依照掩膜版圖形鋪展成了柵狀，??因為未輻照的條帶保持疏水性限制了水的流動。因此我們首先從潤濕性角度證實??了?ＴｉＣｈ納米點表面的微圖案化。??在蛋白吸附層面，我們分別進行了定性及定量評價。血清白蛋白是體液環(huán)境??及體外培養(yǎng)條件中最常見蛋白，因此選用牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作為模型進行實??驗。綠色熒光接枝的ＢＳＡ吸附結(jié)果直觀的反映了蛋白吸附的微圖案化。通過焚光??圖片可以看到清晰的平行蛋白條帶，而且蛋白條帶和間隙的寬度都近似為５０ｐｍ，??這一數(shù)據(jù)與掩膜版上的圖案寬度一致。進而，蛋白吸附的定量實驗（圖３．２Ｂ）顯??示，光照處理明顯增加了?Ｔｉ０２納米點薄膜的蛋白吸附能力，達到１．１４?ｎｇ／ｍｌ，而對??應(yīng)的未光照俎則為不足０．８０?ｎｇ／ｍｌ。掩膜版光照組的結(jié)果位于二者之間

是一種有效地在ＴｉＣｈ納米點薄膜表面構(gòu)建微圖案化線索的方式，而這一微線索，??指導(dǎo)了后續(xù)的蛋白粘附和細胞行為。結(jié)合上一部分對Ｔｉ０２納米點光照功能化原理??的分析，我們用圖示的方式描繪了光控微圖案化的原理。圖３．３Ａ表示的是Ｔｉ０２??納米點光生輕基的產(chǎn)生過程，吸收光能后，ＴｉＣｈ產(chǎn)生光電子，將四價鈥還原成三??價鈥，而空穴則氧化０２＿離子形成氧空位，空氣中的水解離吸附在氧空位上成為形??成端羥基（表面羥基），而隨著黑暗中長期放置，Ｔｉ０２表面會失去水分子重新恢復(fù)??到光照前狀態(tài)。圖３ＢＣＤ分別代表了全光照、未光照及微圖案化光照組樣本的表??面構(gòu)成及蛋白和細胞吸附狀態(tài)。更多的表面羥基有利于初始蛋白的粘附，而蛋白??的粘附則是細胞粘附的基礎(chǔ)。而在微圖案化表面，細胞和蛋白的區(qū)域化粘附則歸??因于光生羥基的圖案化分布。??Ａ?Ｂ?ＣＤ??：?ｒ?ｔ??Ｄａｒｋ?＇?？?＾＇＂＇Ｖ??ＴｉＯＨＢ?ＴｉＯＨＴ?．“，ｖ?■？？？？■，??＾?Ｍ?Ｔ?Ｔ?Ｔ?？?！?？?Ｉｌｌ?＊?＊?Ｔ＾??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｅｌｌ?Ｔｉ?＃?？?？?Ｈ??圖３．３光控細胞定向機制示意圖。（Ａ）光照前Ｔｉ０２表面以橋羥基（ＴｉＯＨＢ）為主，吸收??紫外光照產(chǎn)生光生電子和０２－
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本文編號：2865717