研究目的:本課題旨在應(yīng)用3D打印技術(shù)制備聚己內(nèi)酯(PCL)支架,協(xié)同富血小板血漿(PRP)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)的促成骨作用,構(gòu)建具有良好骨修復(fù)能力的個(gè)體化復(fù)合組織工程骨。研究方法:通過3D打印技術(shù)構(gòu)建不同孔隙率的PCL支架并進(jìn)行力學(xué)性能、孔隙率等相關(guān)檢測(cè)。利用Landesberg二次離心法獲取富血小板血漿(PRP),通過血小板計(jì)數(shù)、電鏡觀察、HE切片染色等方法表征。利用冷凍干燥法制備PCL/PRP復(fù)合支架、PCL/PRP/BMP2復(fù)合組織工程骨。采用全骨髓貼壁法獲取、分離、培養(yǎng)新西蘭大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),定期觀察其生長(zhǎng)狀態(tài),通過成骨、成脂肪、成軟骨細(xì)胞“三系”分化及Western Blot、免疫熒光等檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定。體外細(xì)胞水平觀察PRP/BMP2協(xié)同促成骨分化能力,設(shè)立不同的分組:空白對(duì)照組、PRP組、PRP/BMP2組、成骨誘導(dǎo)液組,通過堿性磷酸酶染色、茜素紅S染色法、PCR法檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、OCN的表達(dá)觀察實(shí)驗(yàn)組促進(jìn)成骨分化的能力。體外水平觀察組織工程骨的促成骨分化及BMSCs的增殖能力,設(shè)立分組:單純PCL支架(普通培養(yǎng)基組)、PCL/PRP復(fù)合支架、PCL/PRP/BMP2復(fù)合組織工程骨組、單純PCL支架(成骨誘導(dǎo)液組),對(duì)各組堿性磷酸酶(ALP)活性進(jìn)行測(cè)定,通過MTT法觀察在單純PCL支架(普通培養(yǎng)基組)、PCL/PRP復(fù)合支架、PCL/PRP/BMP2復(fù)合組織工程骨中BMSCs的增殖情況。建立新西蘭大白兔橈骨中段長(zhǎng)15mm的骨缺損模型,共48只,分4組(每組6×2只)。設(shè)立分組:空白對(duì)照組、單純PCL支架組、PCL/PRP復(fù)合支架組和PCL/PRP/BMP2復(fù)合組織工程骨組。分別在第4周和第12周獲取組織標(biāo)本進(jìn)行大體觀察和X線片觀察骨缺損修復(fù)情況,并用Lane-sandHu X線評(píng)分法對(duì)12周的X線結(jié)果進(jìn)行評(píng)分;組織切片行蘇木精伊紅(HE)和Masson三色染色進(jìn)一步觀察復(fù)合組織工程骨在組織學(xué)水平的骨修復(fù)效果。研究結(jié)果:通過3D打印技術(shù)可獲取合適孔隙率及力學(xué)性能的PCL支架;通過Landesberg二次離心法可獲取理想的富血小板血漿;通過冷凍干燥法可制備PCL/PRP/BMP2復(fù)合組織工程骨。全骨髓貼壁法獲得的兔BMSCs在鏡下呈梭形且貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,培養(yǎng)過程中狀態(tài)穩(wěn)定;該細(xì)胞系在體外誘導(dǎo)條件下可向成骨、成脂肪及成軟骨細(xì)胞分化,具備多功能干細(xì)胞的特點(diǎn);表面標(biāo)記物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞系表達(dá)CD29、CD44,不表達(dá)CD34、CD14。體外細(xì)胞水平觀察各組促成骨分化的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRP/BMP2組堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色的程度最高;且成骨相關(guān)基因OCN和ALP的mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組、PRP組及成骨誘導(dǎo)液組;PCL/PRP/BMP2復(fù)合組織工程骨組堿性磷酸酶蛋白(ALP)的活性定量明顯高于空白對(duì)照組、PRP組及成骨誘導(dǎo)液組;在PCL/PRP復(fù)合支架中培養(yǎng)的BMSCs隔日MTT法所測(cè)的OD高于其他組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的大體觀察及X線檢查結(jié)果顯示4周及12周時(shí)PCL/PRP/BMP2組中骨缺損區(qū)域新生骨明顯優(yōu)于PCL組、PCL/PRP組;12周時(shí)PCL/PRP/BMP2組的Lane-sandHu X線評(píng)分顯著高于其余各組;HE染色及Masson染色結(jié)果進(jìn)一步顯示4周及12周時(shí)PCL/PRP/BMP2組新生骨組織明顯多于PCL組、PCL/PRP組;而空白對(duì)照組兩側(cè)斷端骨性閉合,骨缺損區(qū)少量骨組織生長(zhǎng),無法實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)。研究結(jié)論:應(yīng)用3D打印技術(shù)結(jié)合富血小板血漿和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2可實(shí)現(xiàn)個(gè)體化復(fù)合組織工程骨的構(gòu)建,此復(fù)合組織工程骨具有良好的骨修復(fù)能力,有望成為個(gè)性化修復(fù)臨床骨缺損的方法之一。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R68;R318.08
【部分圖文】：

圖1.1：Landeaserg兩次離心法提取PRP（待鑒定）RP的鑒定RP中血小板計(jì)數(shù) 12 只實(shí)驗(yàn)兔采血，酒精棉球在耳緣靜脈處消毒 2 次，揉搓抽取靜脈血注入抗凝真空管內(nèi)，以測(cè)定兔全血血小板。制備時(shí)同時(shí)抽取的兔全血與兔的PRP一同在血細(xì)胞分析儀中證制備的PRP數(shù)量是否與文獻(xiàn)一致（PRP中血小板是全血的描電鏡觀察（SEM）血小板血漿約 2-3ml，搖勻后加入 0.4ml 激活劑（激活劑為 1000u 凝血酶混合而成），約 4-5 分鐘后形成凝膠狀物質(zhì)，，隨后置于-80℃中冷凍，待冷凍完全后迅速轉(zhuǎn)入冷凍干燥后于-20℃中保存?zhèn)溆�。利用掃描電鏡觀察 RPR 的微觀形

為研究PCL支架外觀形態(tài)，我們采用相機(jī)拍攝觀察，當(dāng)原材料加入MAM系統(tǒng)后，升溫使之熔融，調(diào)整3D打印機(jī)參數(shù)條件，根據(jù)設(shè)計(jì)的STL文件路徑構(gòu)建出PCL支架，大體外觀（圖1.2）可見PCL支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)勻稱、規(guī)則，可按設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化PCL支架打印。圖1.2：PCL支架的大體外觀。2．不同PCL支架孔隙率的測(cè)定根據(jù)PCL柱間距（600μm、800μm和1000μm）分別打印支架，3種不同間距的PCL支架材料孔隙率測(cè)定結(jié)果如下，隨著PCL柱間距增大，孔隙率逐漸增高。表1：不同移動(dòng)間距打印支架的孔隙率，任意兩組間比較P均小于0.05Material n 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差PCL(600) 6 29.70±1.14PCL(800) 6 53.93±1.70PCL(1000) 6 60.48±1.153．PCL支架的掃描電鏡(SEM)結(jié)果為研究原材料在MAM形態(tài)中打印的情況，利用SEM對(duì)支架進(jìn)行微觀觀察，結(jié)果顯示（圖1.3）：MAM系統(tǒng)可將PCL材料通過層層堆疊（layer-by-layer）方式形成孔隙率均勻、孔隙間互通的三維支架結(jié)構(gòu)。

圖1.3：PCL支架的掃描電鏡圖（A: 正面觀，240×；B: 側(cè)面觀，240×）4．力學(xué)性能測(cè)定不同PCL柱間距（600μm、800μm、1000μm）的支架（圖1.4，表2），當(dāng)形變率達(dá)到50%時(shí)，600μm和800μm時(shí)可承受的應(yīng)力強(qiáng)度值分別為12.4±0.64 MPa、11.76±0.77MPa，兩者無明顯差異，而1000μm時(shí)可承受的應(yīng)力強(qiáng)度值為4.82±0.67MPa，較強(qiáng)兩者明顯減小，與前兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。圖1.4：不同PCL柱間距支架的應(yīng)力-形變曲線。表2：形變率達(dá)到50%時(shí)，不同柱間距的支架所呈現(xiàn)的應(yīng)力強(qiáng)度（compressive strength）Material n 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差PCL(600) 5 12
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本文編號(hào)：2864785