在關(guān)節(jié)的活動(dòng)當(dāng)中,膝關(guān)節(jié)軟骨是其中重要的一個(gè)組成部分,它的健康與否直接影響到人們平時(shí)的生命活動(dòng)。由于軟骨的獨(dú)特結(jié)構(gòu),沒(méi)有血液供應(yīng),導(dǎo)致一旦發(fā)生了損傷,很難通過(guò)自身恢復(fù)。當(dāng)前階段采用的針對(duì)軟骨損傷的修復(fù)手段成效都不理想,組織工程在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用,軟骨缺損的治療帶來(lái)了新的曙光。所以探索新型的軟骨工程材料來(lái)進(jìn)行膝關(guān)節(jié)軟骨缺損治療是極其需要的。本文應(yīng)用軟骨細(xì)胞外基質(zhì)之一II型膠原蛋白和目前修復(fù)采用的熱點(diǎn)材料絲素蛋白為基礎(chǔ)材料。由于二者在單獨(dú)作為修復(fù)材料是都有其明顯的缺點(diǎn),所以通過(guò)將其二者的復(fù)合改性作為修復(fù)材料。首先通過(guò)前期建立的方法,在天然蠶絲中提取出絲素蛋白溶液和新鮮的牛肩胛骨制備出II型膠原蛋白。配制絲素蛋白和II型膠原蛋白不同配比的復(fù)合蛋白膜(SF50,SF70,SF90),通過(guò)表觀物理性能,力學(xué)性能,生物相容性來(lái)測(cè)試最佳的配比。首先通過(guò)添加去離子水調(diào)整三種配比材料具有共同的干濕比。通過(guò)冷凍干燥機(jī)和室溫下晾干獲得不同形態(tài)的復(fù)合膜進(jìn)行測(cè)試。晾干后的復(fù)合膜利用Instron萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)試三種配比的復(fù)合膜的力學(xué)性能,并且通過(guò)建立本構(gòu)模型來(lái)驗(yàn)證力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。之后檢測(cè)不同配比的凍干后復(fù)合膜的吸水率和降解率,然后接種軟骨細(xì)胞ADTC-5,通過(guò)活死細(xì)胞雙色熒光染色、MTT法和SEM觀察來(lái)檢測(cè)II型膠原/絲素蛋白不同配比復(fù)合膜的生物相容性。結(jié)果顯示,絲素蛋白和II型膠原蛋白配比為7:3時(shí),復(fù)合膜表現(xiàn)出更加穩(wěn)定的物理性能以及更加優(yōu)越的力學(xué)性能,本構(gòu)模型和力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也展現(xiàn)出了相對(duì)一致的擬合。通過(guò)生物相容性的檢測(cè),SF70復(fù)合膜表現(xiàn)出了軟骨細(xì)胞最大的增殖量。說(shuō)明SF70復(fù)合膜這個(gè)配比適合作為后期軟骨修復(fù)的配比。前一階段不同配比復(fù)合膜驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)完成后。利用SF70這個(gè)配比的混合材料進(jìn)行過(guò)濾去除氣泡,通過(guò)低溫生物3D打印機(jī)制備,經(jīng)真空狀態(tài)下冷凍干燥成型,之后對(duì)支架進(jìn)行去酸和co60輻照滅菌處理。經(jīng)過(guò)孔隙率測(cè)試后,在滅菌好的支架上,接種軟骨細(xì)胞ADTC-5,進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。本文中創(chuàng)新性的引入力學(xué)載荷,通過(guò)驗(yàn)證梯度壓縮應(yīng)變(0%,5%,10%,15%,20%)對(duì)復(fù)合支架進(jìn)行循環(huán)壓縮加載的作用,得到了適合細(xì)胞增殖的最適壓縮應(yīng)變?yōu)?0%。在10%的壓縮應(yīng)變下,循環(huán)加載1天,3天,5天和7天后,分別都通過(guò)MTT,掃描電鏡觀察,PCR熒光定量,HE染色觀察。在10%的壓縮應(yīng)變下,對(duì)支架和細(xì)胞進(jìn)行組織化培養(yǎng),通過(guò)掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)隨著動(dòng)態(tài)培養(yǎng)天數(shù)的增加,軟骨細(xì)胞在復(fù)合支架上的數(shù)量越來(lái)越多,細(xì)胞基本外基質(zhì)連接在一起,幾乎覆蓋了整個(gè)支架表面。MTT,HE染色從數(shù)量上,Real-time PCR從基因表達(dá)上,Western Blot從蛋白分泌是印證了細(xì)胞數(shù)量上的增長(zhǎng)。最后根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),用限位器將支架制備成直徑3.5mm的圓柱體。同時(shí)用限位器將3-4月齡的新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨股骨端制備出直徑3.5mm的圓形缺損。之后將圓柱體支架植入到圓形缺損中,手術(shù)縫合后,飼養(yǎng)2周,4周,6周和8周,對(duì)新西蘭白兔采用耳緣靜脈注射空氣栓塞的方法處死,之后取出修復(fù)區(qū)域,通過(guò)Micro-CT掃描,HE染色和免疫組化染色,來(lái)觀察缺損區(qū)域的修復(fù)情況。結(jié)果顯示肉眼可以看出隨著修復(fù)過(guò)程的進(jìn)行,支架逐漸降解消失,新的軟骨開始形成。Micro-CT的結(jié)果展示出支架不僅表現(xiàn)出對(duì)軟骨的修復(fù),發(fā)現(xiàn)軟骨下骨也開始發(fā)生修復(fù)效果,這為后期進(jìn)行透明軟骨層-軟骨鈣化層-軟骨下骨的分層修復(fù)整合提供了實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。組織學(xué)和免疫組化的染色展現(xiàn)出了新的軟骨及軟骨下骨開始形成。綜上所述,通過(guò)自我探索的尋求驗(yàn)證,配比7:3的絲素蛋白/II型膠原蛋白混合材料對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)以及軟骨缺損的修復(fù)表現(xiàn)出極大的潛力和可能,有望作為后期組織工程修復(fù)軟骨缺損的新型復(fù)合材料。
【學(xué)位單位】：天津理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.17
【部分圖文】：

第一章 緒論1.1 課題研究的背景及意義關(guān)節(jié)軟骨（Articular cartilage，AC）是骨關(guān)節(jié)中非常重要的組成部分，是一種富骨細(xì)胞及其外基質(zhì)的無(wú)血管結(jié)締組織，其中的軟骨外基質(zhì)主要包括二型膠原蛋白、高分子的聚集蛋白聚糖以及極度親水的透明質(zhì)酸。AC 具有層區(qū)纖維特征的非均構(gòu)，從表層區(qū)、中層區(qū)、深層區(qū)、軟骨鈣化層至軟骨下骨，都有著不同的細(xì)胞和分構(gòu)，呈現(xiàn)出不同的生化和形態(tài)特征（見圖 1-1）。在日常的生命活動(dòng)中，關(guān)節(jié)軟骨圍充滿著復(fù)雜的應(yīng)力環(huán)境，在骨關(guān)節(jié)的活動(dòng)中，軟骨充當(dāng)著一個(gè)具有低摩擦的界面表面承受的載荷均勻通過(guò)關(guān)節(jié)軟骨傳遞到下骨部分，為關(guān)節(jié)的活動(dòng)發(fā)揮著保護(hù)和支作用。

2.2.3 絲素蛋白溶液的提取使用托盤天平稱取天然蠶絲 100g，將 4L 去離子水煮沸后，加入無(wú)水碳酸鈉配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%的碳酸鈉水溶液，放入天然蠶絲后煮沸 30min。取出蠶絲在去離子水中清洗干凈，將煮后渾濁液體棄除后，重新在 5%的碳酸鈉水溶液中沸煮洗滌蠶絲兩次。將洗凈后的桑蠶絲擠干水分，平鋪在烘箱內(nèi)，設(shè)置溫度 60 烘干 4 小時(shí)。用托盤天平分別稱取三者摩爾比例為 1:8:2 的無(wú)水氯化鈣、去離子水和無(wú)水乙醇，先將無(wú)水氯化鈣充分溶解在去離子水中，帶溫度冷卻至 60℃時(shí)，倒入三孔瓶中，加入無(wú)水乙醇后，置于恒溫水箱中，設(shè)置恒定保持溫度為 60℃。將烘干后蠶絲充分剪碎后，用鑷子依次放入三孔瓶中，在 60℃水浴下，通過(guò)攪拌機(jī)攪拌 4 小時(shí)。將溶解后的蠶絲溶液倒入洗凈的透析袋中，通過(guò)流動(dòng)的自來(lái)水透析 2 天后，用去離子水浸泡透析，每隔 4h 換一次水，透析 24h，以去除絲素溶解液中的 Ca2+、Cl-等離子。用聚乙二醇 20000 覆蓋在透析后的透析袋上進(jìn)行濃縮，等絲素溶解液濃縮成原體積的三分之一后，用去離子水洗凈透析袋。取干凈的離心管倒入濃縮后的絲素溶液，設(shè)置 8000r/min 的轉(zhuǎn)速，15min 的離心時(shí)間，之后收集離心后溶液的上清液，在 4℃冰箱中密封保存。絲素蛋白提取的過(guò)程如圖 2-1 所示。

第二章 絲素蛋白/II 型膠原復(fù)合膜的力學(xué)性能和力學(xué)行為的本構(gòu)描述洗 3 次，加入含胃蛋白酶（1mg/mL）的冰醋酸溶液，溶解 72h。溶解后倒入離心瓶中，用托盤天平配平后，設(shè)置 8000r/min 的離心速度和離心時(shí)間 10min，離心后取上層清澈的液體。加入預(yù)先配置好的 0.5M 的氫氧化鈉溶液至 PH 值為中性，再加入 NaCl 晶體，析出膠原絮狀體，裝入透析袋中去離子水中透析 4 天。透析過(guò)后通過(guò)進(jìn)行離心去除上清液后進(jìn)行濃縮。收集剩下沉淀，在-20℃冰箱中保存密封。II 型膠原蛋白提取的過(guò)程如圖2-2。
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