目的本課題旨在分析細胞在氧化石墨烯(graphene oxide,GO)支架上附著、生長和鈣化能力,探索GO支架的生物相容性及其作為新型牙再生支架的可行性。方法1采用改良組織塊法培養(yǎng)大鼠牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)并采用CD34、CD44和STRO-1抗體進行免疫熒光染色鑒定。采用酶消化法培養(yǎng)胎鼠下頜突的牙源性上皮細胞(dental epithelial cells,DECs)并采用CK14抗體進行免疫熒光染色鑒定。2采用Hummers法和梯度冷凍干燥法制備三維GO支架,通過掃描電鏡觀察支架表面形態(tài),拉曼光譜儀進行材料成分測定。3將DPSCs分別接種到α-MEM培養(yǎng)基(對照組)和含有不同濃度GO分散液的培養(yǎng)基(實驗組)內(nèi),24小時后通過MTT法檢測各組吸光度,計算出細胞成活率,以分析GO是否有細胞毒性。4將GO支架放入有DPSCs細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天,用免疫熒光染色法檢測tubulin-β,以觀察細胞在支架上的附著情況。5按照分層接種法將DPSCs和DECs按照1:1的比例接種到GO支架(DPCSs/DECs/GO組)和明膠海綿支架(DPCSs/DECs/GS組)上,在體外構(gòu)建上皮—間充質(zhì)干細胞立體培養(yǎng)模型并移植到大鼠大網(wǎng)膜內(nèi)。4周后取材,行組織學(xué)觀察和牙本質(zhì)涎蛋白(Dentin sialoprotein,DSP)的免疫組化染色,檢測移植物內(nèi)組織的生成狀況。采用掃面電鏡觀察移植物內(nèi)組織形態(tài),能譜儀測定移植物內(nèi)鈣磷元素含量,X線衍射儀測定移植物組織結(jié)構(gòu),與正常牙齒進行對比,檢測礦化程度。動物體內(nèi)實驗是為了活體分析細胞在GO支架上的分化能力。結(jié)果1培養(yǎng)所得牙髓細胞不表達造血干細胞表面標記物CD34,陽性表達間充質(zhì)干細胞表面標記物CD44和STRO-1,證實該細胞為DPSCs。培養(yǎng)所得下頜突細胞陽性表達上皮細胞標記物CK14,證實該細胞為DECs。2 GO支架表征學(xué)測定結(jié)果表明,該支架孔徑為50-100μm,孔隙率高達95%,表面有皺褶結(jié)構(gòu);拉曼光譜結(jié)果顯示,D峰出現(xiàn)在1355cm-1,G峰出現(xiàn)在1582cm-1,符合GO的特點。3 MTT實驗結(jié)果顯示,GO分散液組細胞活性與α-MEM組無顯著性差異(P0.05),說明GO無細胞毒性。4免疫熒光結(jié)果顯示DPSCs細胞在GO支架上生長良好,能夠很好地黏附和伸展。說明GO具有良好的生物相容性。5動物體內(nèi)實驗結(jié)果:HE染色顯示每組支架均有新生組織長入,細胞生長良好,DPCSs/DECs/GO組可見均質(zhì)紅染的鈣化物質(zhì)形成;免疫組化染色可見DPCSs/DECs/GS組DSP陰性表達,個別地方呈弱陽性。而DPCSs/DECs/GO組DSP呈強陽性;掃描電鏡圖像可見DPCSs/DECs/GO組內(nèi)有膠原和血管形成,細胞生長良好。能譜儀檢測結(jié)果顯示移植物內(nèi)有少量鈣磷物質(zhì)表達,X線衍射儀結(jié)果可見移植物尚未達到正常牙齒的礦化水平,說明礦化程度較低。動物實驗結(jié)果表明與GS相比GO支架更有助于DPSCs分化。結(jié)論1采用改良組織塊法能夠獲得大鼠DPSCs;采用酶消化法可以培養(yǎng)出胎鼠DECs。2 GO支架具有良好的生物相容性,有利于DPSCs的生長與附著。3 GO作為牙再生新型支架,對DPSCs體內(nèi)牙向分化具有一定的促進作用。圖14幅;表1個;參110篇。
【學(xué)位單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R783.1
【部分圖文】：

P<0.05 表示各組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。.3 實驗結(jié)果.3.1 石墨烯支架的表征測定SEM 結(jié)果顯示，采用梯度冷凍干燥法獲得的 GO 支架具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑0-100μm(圖 6A 左)，孔隙率高達 95%，同時放大倍數(shù)后可以發(fā)現(xiàn)，支架表面有皺褶(圖 6A 右)，皺褶結(jié)構(gòu)更有利于細胞的黏附。拉曼光譜是一種散射光譜，用的，具有高分辨率的表征碳材料的技術(shù)，通過波峰的位置，強度和形狀，可材料成分進行鑒定。GO 拉曼光譜主要有 D 峰和 G 峰，D 峰一般出現(xiàn)在 1350c 附近，是由 SP2 的無序震動引起；G 峰在 1580cm-1 附近，于碳原子面內(nèi)震動的。本實驗 GO 拉曼光譜結(jié)果顯示(圖 6B)，D 峰出現(xiàn)在 1355cm-1，G 峰出現(xiàn)582cm-1，符合 GO 的特點；75%酒精浸泡消毒后的 GO 拉曼光譜同消毒前，說5%酒精未對 GO 性能造成影響。

兩組數(shù)據(jù)比較采用 t 檢驗，P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果移植物的組織學(xué)觀察內(nèi)移植(圖 8)后，所有動物均按時蘇醒，生命體征正常，3 天后精神。移植物移植 4 周全部后取出，肉眼可見每組標本均被纖維結(jié)締組織包S 組完全被吸收，未采集到標本。HE 染色可見其余三組細胞生長狀具有良好的生物相容性；DECs+DPSCs/GO 組可見 GO 支架孔隙內(nèi)有個別區(qū)域可見少數(shù)深染鈣化灶，局部放大可見均質(zhì)紅染的鈣化結(jié)構(gòu)；DECs+DPSCs/GS 組中 GS 支架已被吸收，無支架結(jié)構(gòu)剩余，絕大多結(jié)構(gòu)，未見鈣化區(qū)域，血管生成較少(圖 10B)；GO 組可見細胞聚集在大多數(shù)為長入的纖維結(jié)締組織(圖 10C)。所有組均未見典型的牙髓牙本

- 26 -注：各組 DSP 平均光密度值比較，* P<0.05。圖 12 各組 DSP 平均光密度值比較.12 Comparison of the average optical density of DSP in each group掃描電鏡觀察結(jié)果鏡可以觀察到正常牙齒的釉牙本質(zhì)界，釉柱，牙本質(zhì)小ECs/GO 組可以清晰地觀察到大量排列無序的膠原形成管(圖 13)。表明 GO 支架具有良好的生物相容性。移植形態(tài)有類似之處，加之有小血管生成，可以推測該組織趨勢，但暫無明確驗證指標，該結(jié)果只能作為參考。
【參考文獻】

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本文編號：2844507