研究背景:選擇性細(xì)胞滯留技術(shù)(SCR)作為骨組織工程在構(gòu)建策略上的改進(jìn),已用于臨床即刻構(gòu)建即用型骨移植物以滿足包括骨缺損修復(fù)、脊柱和關(guān)節(jié)融合等多種手術(shù)對(duì)骨移植材料的需求。細(xì)胞-支架材料的粘附是構(gòu)建組織工程人工移植物的首要環(huán)節(jié),尤其在SCR技術(shù)中,提高骨髓液中以MSCs為代表的成骨前體細(xì)胞與支架材料的粘附效率是提高SCR構(gòu)建骨移植物成骨活性的關(guān)鍵。非受體型酪氨酸磷酸酶PTP1B是整合素介導(dǎo)的細(xì)胞-基質(zhì)粘附和鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附在通路對(duì)話中的關(guān)鍵樞紐,據(jù)推測(cè),PTP1B Y152位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)可能是平衡上述兩組截然不同又相互關(guān)聯(lián)的粘附通路的重要支點(diǎn)。特異性抑制PTP1B Y152位點(diǎn)磷酸化或可在弱化鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附的同時(shí)強(qiáng)化整合素介導(dǎo)的細(xì)胞-基質(zhì)粘附。方法:1)為特異性抑制PTP1B Y152位點(diǎn)磷酸化,選取以PTP1B Y152位點(diǎn)為中心的15氨基酸長(zhǎng)度的序列,并在其C端連接11氨基酸長(zhǎng)度的TAT穿膜結(jié)構(gòu)域,以固相合成法獲取26氨基酸長(zhǎng)度的PTP1B Y152結(jié)構(gòu)域模擬肽(152RM肽)及其Y152/153f突變對(duì)照肽以及FITC熒光標(biāo)記的上述多肽并進(jìn)行序列的準(zhǔn)確性鑒定。2)采用激光共聚焦顯微鏡以FITC熒光標(biāo)記的152RM肽或突變序列肽示蹤其對(duì)人屬骨髓來(lái)源的懸浮狀態(tài)MSCs的入胞過(guò)程。設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)以Western Blot檢測(cè)152RM肽對(duì)懸浮狀態(tài)MSCs中PTP1B Y152位點(diǎn)磷酸化抑制效應(yīng)的時(shí)效-量效關(guān)系。3)以Western Bolt和Co-IP檢測(cè)通過(guò)152RM肽干預(yù)PTP1B Y152位點(diǎn)磷酸化后對(duì)粘附相關(guān)蛋白磷酸化以及蛋白間結(jié)合量的影響;以抑制劑在不同層面干預(yù)、以Western Blot探索152RM肽的作用機(jī)制;以活/死細(xì)胞染色檢測(cè)152RM肽的細(xì)胞相容性。4)設(shè)計(jì)“沉降粘附法”均一化細(xì)胞粘附的起始時(shí)間、觀察MSCs的粘附鋪展能力并在早期粘附2-10分鐘準(zhǔn)確的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)提取總蛋白,以Western Blot檢測(cè)細(xì)胞早期粘附中Src和FAK的磷酸化變化譜、以Pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞早期粘附中Rho家族粘附相關(guān)的關(guān)鍵小G蛋白R(shí)ac1、Cdc42和RhoA的活性變化譜。5)采用基于“沉降粘附法”的離心細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSCs在早期粘附中的基質(zhì)錨定能力并觀察MSCs中晚期鋪展鋪展形態(tài);基于優(yōu)化的接種方法在MSCs早期粘附2-10分鐘的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)對(duì)細(xì)胞骨架染色觀察其粘附形態(tài)、細(xì)胞骨架重構(gòu)以及絲狀偽足和板狀偽足形成情況、并定量檢測(cè)MSCs在20-100分鐘中晚期粘附的時(shí)間-面積曲線。6)在SCR技術(shù)中使用經(jīng)152RM肽預(yù)孵育的骨髓液對(duì)DBM支架材料進(jìn)行富集,洗脫細(xì)胞后以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD271~+細(xì)胞、CD90~+/CD105~+細(xì)胞和有核細(xì)胞在DBM中滯留的絕對(duì)數(shù)量及其在總有核細(xì)胞中的相對(duì)占比。7)以qPCR、Western Blot、堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒和CCK-8法檢測(cè)152RM肽干預(yù)下MSCs成骨標(biāo)志物在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)層面的水平和MSCs的增殖能力。8)采用模擬SCR技術(shù)或傳統(tǒng)浸漬修飾法以FITC熒光標(biāo)記的152RM肽對(duì)DBM進(jìn)行修飾,以激光共聚焦顯微鏡定量分析材料的算術(shù)平均熒光強(qiáng)度以檢測(cè)在SCR技術(shù)的富集流程中152RM肽在材料上是否有余留量;以qPCR檢測(cè)余留152RM肽對(duì)MSCs成骨分化能力的影響并與浸漬修飾法和衡量肽干預(yù)組作對(duì)比。9)提取核蛋白檢測(cè)β-catenin的核定位量,采用抑制劑在Wnt/β-catenin和整合素通路不同層面干預(yù),以Western Blot探索152RM肽誘導(dǎo)MSCs成骨分化的通路途徑。10)采用裸鼠皮下成骨模型和裸鼠股骨旁成骨模型,經(jīng)Micro-CT定量以及HE和Masson’s染色定性分析,分別檢測(cè)在SCR技術(shù)中使用152RM肽預(yù)孵育骨髓對(duì)DBM富集制備的骨移植物在體內(nèi)的骨形成能力。結(jié)果:1)經(jīng)商業(yè)合成獲取了高純度的152RM肽、Y152/153f突變對(duì)照肽以及FITC熒光標(biāo)記的上述多肽,各肽對(duì)經(jīng)鑒定的懸浮狀態(tài)MSCs可在60分鐘內(nèi)有效穿膜入胞;152RM肽對(duì)懸浮狀態(tài)的MSCs在作用60分鐘時(shí)對(duì)全長(zhǎng)或酶切的PTP1B Y152磷酸化抑制的最低有效濃度可至0.33μM,且152RM肽未對(duì)MSCs顯示出明顯的細(xì)胞毒性。2)以152RM肽干預(yù)60分鐘后,懸浮狀態(tài)的MSCs中全長(zhǎng)或酶切的PTP1B Y152磷酸化水平大幅下降、β-catenin Y654磷酸化水平顯著上調(diào),Src抑制位點(diǎn)Y530磷酸化水平顯著下調(diào)、自磷酸化激活位點(diǎn)Y419磷酸化水平顯著上升;總鈣黏蛋白分別與全長(zhǎng)或酶切的PTP1B本體以及β-catenin本體的結(jié)合量顯著下降,突變對(duì)照肽不具備上述效應(yīng),而PTP1B的特異性抑制劑TCS-401可顯著逆轉(zhuǎn)上述蛋白磷酸化的改變。3)基于“沉降粘附法”的離心細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示以152RM肽干預(yù)60分鐘的MSCs在早期粘附中具備更強(qiáng)的基質(zhì)錨定能力;基于“沉降粘附法”在細(xì)胞的中晚期粘附中定性觀察到經(jīng)152RM肽孵育的MSCs展示出更為活躍的細(xì)胞粘附和鋪展能力。4)基于優(yōu)化的細(xì)胞接種方法在細(xì)胞早期粘附2-10分鐘的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)觀察到經(jīng)152RM肽孵育的MSCs在更早的時(shí)間啟動(dòng)細(xì)胞粘附、展示出更廣泛的絲狀偽足和板狀偽足形成并提早展示出一定的各向異性粘附形態(tài),而PTP1B抑制劑TCS-401以及Src抑制劑Bosutinib可顯著抑制上述效應(yīng);MSCs中晚期粘附的鋪展時(shí)間-面積曲線顯示經(jīng)152RM肽孵育的MSCs在粘附20至60分鐘時(shí)鋪展面積顯著高于Vehicle對(duì)照組,但在粘附80分鐘和100分鐘時(shí)兩組的差異值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5)在2-10分鐘的細(xì)胞早期粘附中,經(jīng)152RM肽孵育的MSCs中Src、FAK激酶以及小G蛋白R(shí)ac1和Cdc42在粘附起始前和粘附過(guò)程中活性均高于Vehicle對(duì)照組,而晚期粘附標(biāo)志的小G蛋白R(shí)hoA活性顯著低于Vehicle對(duì)照組。6)以152RM預(yù)孵育的骨髓液中CD271~+細(xì)胞、CD90~+/CD105~+細(xì)胞在SCR技術(shù)中粘附滯留于DBM的絕對(duì)數(shù)量及其在總有核細(xì)胞中的占比均顯著高于Vehicle對(duì)照組,PTP1B抑制劑TCS-401或Src抑制劑Bosutinib可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。7)在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中,152RM肽可上調(diào)MSCs成骨分化指標(biāo)RUNX2、OCN和COL-1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平并上調(diào)ERK1/2 T202/Y204位點(diǎn)磷酸化水平,且152RM對(duì)貼壁MSCs的PTP1B Y152、β-catenin Y654和Src Y530/Y419磷酸化產(chǎn)生與在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中對(duì)懸浮狀態(tài)MSCs類(lèi)似的效應(yīng)。8)152RM肽對(duì)MSCs在DBM上的增殖無(wú)顯著作用,生長(zhǎng)培養(yǎng)環(huán)境和成骨誘導(dǎo)環(huán)境中β-catenin的核定位量無(wú)明顯改變;模擬SCR技術(shù)中余留于DBM的152RM肽可有效促進(jìn)MSCs成骨分化;PTP1B、Src和ERK1/2抑制劑可逆轉(zhuǎn)152RM肽對(duì)MSCs成骨分化的促進(jìn)效應(yīng),但Wnt/β-catenin經(jīng)典途徑干預(yù)劑不能有效逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。9)以152RM肽孵育的骨髓液在SCR技術(shù)中對(duì)DBM富集制備的骨移植物在裸鼠皮下成骨模型和裸鼠股骨旁成骨模型中均展示出更好的體內(nèi)骨形成能力。結(jié)論:152RM肽通過(guò)特異性抑制MSCs中PTP1B Y152位點(diǎn)的磷酸化水平,在弱化鈣黏蛋白粘附通路的同時(shí)強(qiáng)化整合素粘附通路,并通過(guò)整合素通路途徑促進(jìn)了MSCs成骨分化。在SCR技術(shù)中采用152RM肽預(yù)孵育的骨髓液對(duì)DBM進(jìn)行細(xì)胞富集有效增加了MSCs在DBM中的粘附效率及其成骨分化能力,以該方法制備的骨移植物在體內(nèi)具備更優(yōu)的骨形成能力,證實(shí)通過(guò)提高M(jìn)SCs的自身粘附能力以增強(qiáng)其在SCR技術(shù)中粘附效率并提高SCR技術(shù)制備骨移植物體內(nèi)成骨活性的可行性和有效性。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R318
【部分圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文2.2 結(jié) 果2.2.1 肽的結(jié)構(gòu)示意圖及序列準(zhǔn)確性鑒定(1) PTP1B 結(jié)構(gòu)域模擬肽及其突變肽的結(jié)構(gòu)示意圖本研究涉及的帶 TAT 穿膜序列的 PTP1B 結(jié)構(gòu)域模擬肽（152RM）、152RM（Y152/153f）突變肽以及 FITC 熒光標(biāo)記的各肽經(jīng)綜合考慮其理論半衰期、生物活性和實(shí)際溶解度等方面，將 TAT 穿膜序列（YGRKKRRQRRR 序列）置于各肽的 C 端。各肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖如下（圖 2-1）：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文(2) 形態(tài)和多向分化能力鑒定本項(xiàng)目各實(shí)驗(yàn)中所采用的細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)的典型長(zhǎng)梭形細(xì)胞，光鏡下可見(jiàn)質(zhì)膜立體透亮、邊界明晰圓潤(rùn)。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后可見(jiàn)磨砂樣的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)節(jié)和礦化沉積，可由茜素紅深染；經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后可見(jiàn)薄層膠體樣的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，可由甲苯胺藍(lán)深染；經(jīng)成脂誘導(dǎo)后以油紅 O 染色可見(jiàn)胞內(nèi)大量紅染的脂滴聚集。上述結(jié)果顯示細(xì)胞可被成功誘導(dǎo)向骨、軟骨和脂細(xì)胞方向分化。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，本項(xiàng)目各實(shí)驗(yàn)中所采用的細(xì)胞在生物學(xué)特征上符合 ISCT 對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞的描述[29]，可鑒定為合格的間充質(zhì)干細(xì)胞（圖 2-4）。

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文光、胞質(zhì)可檢測(cè)到分布不均勻的低強(qiáng)度熒光；在孵育 30 分鐘時(shí)，MSCs 胞質(zhì)出現(xiàn)分布不均勻的熒光、核膜出現(xiàn)明顯的熒光聚集并繼續(xù)累積至核內(nèi)；在孵育 60 分鐘組多肽均已在胞質(zhì)大量積累，其中 152RM 肽在 MSCs 胞質(zhì)的分布不均勻、呈現(xiàn)定的網(wǎng)格狀分布，而突變對(duì)照肽在 MSCs 胞質(zhì)的分布較為均勻（圖 2-5）。
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本文編號(hào)：2841160