病竇綜合征、房室傳導(dǎo)阻滯等是常見的心律失常疾患,嚴(yán)重危害人類健康。目前的治療方法主要是植入電子起搏器。但是電子起搏器仍然有很多缺點(diǎn)無法克服,如囊袋血腫、感染等。生物心臟起搏器成為心律失常領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。鑒于基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建生物心臟起搏器技術(shù)的缺陷,細(xì)胞移植和組織工程化起搏、傳導(dǎo)組織移植,可能是生物心臟起搏器應(yīng)用于臨床的惟一或重要途徑。無論是細(xì)胞移植、還是組織工程化起搏、傳導(dǎo)組織移植構(gòu)建生物心臟起搏器,首先必須解決的是種子細(xì)胞問題。近年來研究發(fā)現(xiàn),骨髓中存在一種體積較小、干性較強(qiáng)的胚胎樣干細(xì)胞(Embryonic-like stem cells,ELSCs),由于該細(xì)胞可來源自體、無免疫排斥反應(yīng);具有胚胎干細(xì)胞的特性,易于誘導(dǎo)分化;應(yīng)當(dāng)是誘導(dǎo)分化為心起搏細(xì)胞的理想種子細(xì)胞之一,但目前未見其向心起搏細(xì)胞誘導(dǎo)分化的報道。ELSCs分離與培養(yǎng),是向心起搏細(xì)胞誘導(dǎo)分化的物質(zhì)基礎(chǔ),目前已報道分離培養(yǎng)ELSCs的方法,存在方法復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、技術(shù)要求高、多用血清等特點(diǎn),擬獲得活性好、純度高的ELSCs,有必要積極開展ELSCs分離與培養(yǎng)方法的研究。干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,是獲得移植細(xì)胞和構(gòu)建組織工程化組織、器官種子細(xì)胞的主要手段。鑒于基因編輯的誘導(dǎo)分化有較多未研究清楚的問題,非基因干涉的誘導(dǎo)分化方法,值得進(jìn)行深入探討�；谝陨嫌^點(diǎn),本課題擬以ELSC為種子細(xì)胞;采用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)、明膠包被及無血清培養(yǎng)的方法,分離培養(yǎng)ELSC;化學(xué)和微環(huán)境模擬的方法誘導(dǎo)ELSC向起搏細(xì)胞分化,以探討體外誘導(dǎo)ELSC分化為心起搏細(xì)胞的可能性,為生物起搏器的臨床應(yīng)用,奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分ELSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定研究目的研究ELSC的分離純化和鑒定方法、生物學(xué)特性,獲取可以用于誘導(dǎo)起搏細(xì)胞的種子細(xì)胞,并與MSC對比其干性強(qiáng)弱,確定其幼稚程度,探討其來源。材料和方法采用全骨髓培養(yǎng)、明膠包被、無血清培養(yǎng)的方法,培養(yǎng)1月大SD大鼠骨髓細(xì)胞,5天后進(jìn)行第一次傳代,以后每2天傳代一次。觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡法檢測干性標(biāo)志物的表達(dá),ELISA檢測端粒酶含量,并與MSC相比較。結(jié)果獲得的ELSC呈長梭形,體積小且形態(tài)均一。分離得到的MSC體積較大,有長梭形、三角形、圓形等多種形態(tài),傳代后細(xì)胞變得扁平,呈現(xiàn)老化特征。免疫熒光、免疫印跡法檢測,ELSCs與MSCs相比,ELSCs的SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog等干性基因高表達(dá),端粒酶含量高。結(jié)論通過全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)、明膠包被和無血清培養(yǎng),獲得了干性較強(qiáng)、具有胚胎樣干細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的ELSC,ELSC可能是存在于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種較幼稚、原始,具有胚胎干細(xì)胞特性的亞群。第二部分ELSC向心起搏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究目的誘導(dǎo)ELSC向心起搏細(xì)胞分化,探討非基因干涉的方法誘導(dǎo)ELSC向心起搏細(xì)胞分化的可能性。材料和方法分別采用5-氮雜胞苷、竇房結(jié)上清液、竇房結(jié)裂解液、竇房結(jié)共培養(yǎng)和聯(lián)合誘導(dǎo)分化的方法,誘導(dǎo)ELSC向起搏細(xì)胞分化。觀測誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的形態(tài),免疫熒光、RT-PCR、免疫印跡法等檢測cTnT、HCN4、Cx45等相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)。結(jié)果ELSC向起搏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,3周后免疫熒光顯示,竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)組表達(dá)cTnT和Cx45,5-aza組和上清液組HCN4為弱陽性表達(dá);免疫印跡法顯示,HCN4和Cx45的表達(dá),聯(lián)合誘導(dǎo)共培養(yǎng)裂解液上清液5-aza;PCR顯示,聯(lián)合誘導(dǎo)組起搏相關(guān)基因的表達(dá)高于其他組;流式細(xì)胞檢測HCN4的表達(dá),從5-aza誘導(dǎo)組的4%、共培養(yǎng)組的15%、聯(lián)合誘導(dǎo)組提高到25%左右。但各組誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞,均未出現(xiàn)自發(fā)搏動的細(xì)胞。結(jié)論單一方法難以將ELSC誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞,聯(lián)合誘導(dǎo)分化的方法,雖然未出現(xiàn)自發(fā)搏動的細(xì)胞,但是具有了早期心細(xì)胞的特點(diǎn),高表達(dá)起搏細(xì)胞的HCN4和CX45,是最有可能將ELSC誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞的方法。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R54;R318.08
【部分圖文】：

圖1-1 ELSC和MSC形態(tài)（標(biāo)尺100μm）A：ELSC原代第三天（×100）B：MSC原代第三天（×100）C：ELSC原代第五天（×100）D：MSC原代第八天（×100）E：第五代ELSC（×100） F：第五代MSC（×200）ELSC與MSC的生長曲線可以看出，ELSC從第2天就進(jìn)入對數(shù)生長期，第6天后進(jìn)入平對數(shù)生長期較ELSC晚，且在第7天才進(jìn)入平臺期。

圖1-2 ELSC和MSC的生長曲線（三）ELSC與MSC的免疫熒光檢測疫熒光顯示ELSC表達(dá)CD73、CD90、CD105，而CD34、CD45（造血干、Laminin a-2（成纖維細(xì)胞標(biāo)志物）均為陰性。干性標(biāo)志物方面ELSC-4、Oct-4、Nanog、Sox2，而SSEA-1弱表達(dá)。

圖1-3 ELSC的免疫熒光檢測結(jié)果（P3）A：SSEA-1+; B：SSEA-4+; C: Nanog+; D：Oct-4+;E：Sox2+； F：CD105+； G:CD73+； H：CD90+）ELSC與MSC的流式檢測胞儀檢測細(xì)胞檢測ELSC的表面標(biāo)志物表達(dá)，結(jié)果ELSC表達(dá)CD73、C純度均高于95%，白細(xì)胞分化抗原CD14、造血干細(xì)胞特異性標(biāo)志物性，表達(dá)低于5%。而在干性標(biāo)志物的表達(dá)上，ELSC表達(dá)Nanog（21.29%）、SSEA-4（81.07%）、Sox-2（71.23%），而MSC組基本不表達(dá)N-2（均低于5%），低表達(dá)SSEA-4（8.13%）。

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4 ;誘導(dǎo)分化讓癌細(xì)胞有了“克星”[N];上�？萍紙�;2008年

5 施嘉奇;老鼠脂肪中獲取干細(xì)胞[N];文匯報;2004年

6 吳立明;成也“有毒”，敗也“有毒”[N];中國醫(yī)藥報;2002年

7 本報記者 李映;協(xié)和干細(xì)胞 鞏固領(lǐng)先地位 擴(kuò)大應(yīng)用范圍[N];中國電子報;2010年

8 本報記者 黃尖尖;讓“科技大協(xié)同”景象重現(xiàn)[N];解放日報;2018年

9 本報記者　江世亮;永遠(yuǎn)的“多利”[N];文匯報;2006年

10 唐傳兵;植物謎題[N];光明日報;2013年

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2 張秀英;VEGF在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用及分化機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2004年

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本文編號：2826002