研究目的:胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(human placental-derived mesenchymal stem Cells,HPMSCs),是取于人足月胎盤組織中的一種新的成體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),HPMSCs因取材便利,來源豐富,具成骨、成脂等多向分化潛能及免疫抑制等眾多優(yōu)勢,近幾年來備受學(xué)者關(guān)注。骨礦化蛋白-1(LIM mineralization protein 1,LMP-1)作為細(xì)胞內(nèi)非分泌蛋白,在人和動物的骨骼、肺臟、脾臟、白細(xì)胞及人牙周膜細(xì)胞、牙髓細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等中均有不同水平的表達(dá),在骨基質(zhì)的礦化過程及成骨細(xì)胞分化過程中起著重要作用。目前為止,關(guān)于LMP-1促HPMSCs成骨分化作用機(jī)制尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)預(yù)構(gòu)建長久穩(wěn)定表達(dá)LMP-1蛋白的HPMSCs,并對LMP-1在促骨形成過程中釋放的細(xì)胞因子相關(guān)的成骨信號通路進(jìn)行初步探討。研究方法:1.組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞,獲得較純的HPMSCs后對其進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo),驗(yàn)證其多向分化能力。2.同一感染復(fù)數(shù)下分別用腺病毒和慢病毒載體系統(tǒng)感染HPMSCs,3天、7天后于熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建重組LMP-1慢病毒表達(dá)體系,包裝純化后感染HPMSCs,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過qPCR和Western Blotting檢測LMP-1基因及蛋白的表達(dá)情況。3.CCK-8法檢測LMP-1對HPMSCs增殖的影響,成骨誘導(dǎo)一周后,通過ALP染色和活性檢測,實(shí)時定量PCR與Western Blotting檢測成骨相關(guān)基因TGF-β1,Smad2,Runx2的表達(dá)情況,比較空白對照組,陰性對照組,LMP-1高表達(dá)組三組細(xì)胞成骨分化能力的差異。結(jié)果:1.鏡下觀察HPMSCs傳至第三代后呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài);成骨誘導(dǎo)14天后行堿性磷酸酶染色見藍(lán)染區(qū)域,21天后行茜素紅染色鏡下見礦化結(jié)節(jié);成脂誘導(dǎo)21天后行油紅O染色鏡下見脂滴形成。2.感染3天時腺病毒感染率略高于慢病毒,到第7天時慢病毒仍有較高表達(dá)率,而腺病毒載體已近乎不表達(dá)。成功構(gòu)建了重組LMP-1慢病毒表達(dá)載體,包裝純化后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株,LMP-1的mRNA和蛋白水平均高表達(dá)。3.CCK-8結(jié)果顯示高表達(dá)LMP-1組細(xì)胞增殖能力減弱,高表達(dá)LMP-1組礦化能力,ALP活性,成骨細(xì)胞因子TGF-β1,Smad2,Runx2表達(dá)水平均上升。結(jié)論:1、成功分離培養(yǎng)了HPMSCs,并鑒定其具有多向分化潛能,符合干細(xì)胞特征。2、相同感染復(fù)數(shù)下,慢病毒載體相比于腺病毒載體感染HPMSCs的感染率高。成功構(gòu)建了重組LMP-1慢病毒載體,并篩選出HPMSCs-LMP1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。3、LMP-1可能通過提高TGF-β1/Smad2信號通路中TGF-β1,Smad2,Runx2的表達(dá)量來促進(jìn)HPMSCs成骨向分化。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R783.1
【部分圖文】：

（6）吸走油紅 O 染液，用 60%異丙醇脫色 3 秒，吸棄。（7）將六孔板每孔加入 2mL PBS，置于顯微鏡下觀察染色效果。2.3 結(jié)果2.3.1 HPMSCs 的形態(tài)及生長狀況組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)得到原代細(xì)胞，約 7 天左右即可在鏡下觀察到少量貼壁細(xì)胞從組織塊周圍爬出呈長梭形，并可看到血細(xì)胞等雜細(xì)胞（圖 2.1A）。經(jīng)過數(shù)次換液后約 20 天左右即可看到組織塊周圍有較多梭形細(xì)胞呈放射狀排列，生長迅速（圖 2.1B）。傳至三代時即可得到形態(tài)單一，貼壁緊密，純度較高的胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞呈旋渦狀生長（圖 2.1C）。

圖 2.2 HPMSCs 成骨分化Figure 2.2 Osteogenic differentiation of HPMSCs2.3.3 HPMSCs 的成脂誘導(dǎo)分化檢測成脂誘導(dǎo)第 10 天，鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有微小脂滴出現(xiàn)（圖 2.3A），隨著時間延長可見脂滴增大融合，21 天后油紅 O 染色“陽性”，脂滴染成紅色（圖 2.3B）。

HPMSCs成脂分化

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2822442