背景:軟骨缺損的治療和軟骨相關(guān)美容是整形外科的重要內(nèi)容,傳統(tǒng)自體移植的方法存在諸多問題,例如來源有限、供區(qū)受損、不同程度軟骨吸收等等。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為此開辟了新的手段。軟骨組織工程技術(shù)處于研究階段,尚未在臨床廣泛開展,還有許多技術(shù)難題需要解決,例如如何在體外獲得大量表型良好的種子細(xì)胞,如何找到制作簡(jiǎn)單、生物相容性好的支架等。微載體技術(shù)用于大規(guī)模擴(kuò)增貼壁細(xì)胞已經(jīng)有數(shù)十年歷史,三維的培養(yǎng)環(huán)境和體內(nèi)環(huán)境更加接近,更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)揮功能,此外,隨著微載體材料的不斷進(jìn)展,微載體除了培養(yǎng)細(xì)胞,還可以作為組織工程的支架。常用的合成聚合物左旋聚乳酸(Poly-L-lacticacid,PLLA)材料制造的多孔微球載體對(duì)細(xì)胞親和性不夠,有研究證實(shí)絲素蛋白(silk fibroin,SF)可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng),我們使用絲素修飾的方法對(duì)左旋聚乳酸多孔微球載體進(jìn)行改進(jìn),為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和軟骨組織工程提供一種新的多孔微球載體和支架。目的:1、明確微載體三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)對(duì)耳廓軟骨細(xì)胞增殖和表型的影響,為建立規(guī)模化擴(kuò)增提供技術(shù)參考。2、對(duì)比左旋聚乳酸(PLLA)多孔微球載體、絲素蛋白(SF)修飾PLLA多孔微球載體、市售商業(yè)微球載體Cultispher G三種微載體體外培養(yǎng)對(duì)耳廓軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為軟骨細(xì)胞三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)尋找合適的載體。3、利用多孔微球載體在兔鼻背處構(gòu)建可注射性組織工程軟骨,并探討使用這種方法隆鼻的效果。方法:1、應(yīng)用胰酶、膠原酶消化法分離豬耳軟骨細(xì)胞,并將獲得的軟骨細(xì)胞分為3組培養(yǎng):培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)、微載體三維靜止培養(yǎng)和微載體三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。應(yīng)用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)、熒光倒置顯微鏡、冰凍切片DAPI染色觀察細(xì)胞在微球上的生長(zhǎng)情況,DNA定量檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖情況,Real-time PCR檢測(cè)軟骨相關(guān)基因表達(dá)。2、應(yīng)用胰酶、膠原酶消化法分離兔耳軟骨細(xì)胞,將獲得的P1代軟骨細(xì)胞分別接種于PLLA、SF修飾PLLA和Cultispher G多孔微球上,并于旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(rotary cell culture system,RCCS)中進(jìn)行培養(yǎng)。應(yīng)用電鏡和冰凍切片DAPI染色觀察細(xì)胞在微球上的生長(zhǎng)情況,DNA定量檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖情況,Real-time PCR檢測(cè)軟骨相關(guān)基因表達(dá),組織學(xué)檢測(cè)軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)分泌情況。3、將兔耳軟骨細(xì)胞接種于SF修飾的PLLA多孔微球支架上,體外培養(yǎng)1周,和透明質(zhì)酸混合后注入兔鼻背處,大體觀察隆鼻效果,組織學(xué)檢測(cè)觀察組織工程軟骨形成情況。以透明質(zhì)酸混合軟骨細(xì)胞和單純透明質(zhì)酸作為對(duì)照。結(jié)果:1、培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)時(shí),軟骨細(xì)胞在4 d時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期,微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)為2-10 d,細(xì)胞數(shù)量在14 d達(dá)到高峰,微球靜止培養(yǎng)組細(xì)胞增殖速度緩慢;在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)中,二維單層培養(yǎng)和微載體靜止培養(yǎng)軟骨表型喪失,而微載體三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí),能夠維持軟骨表型。2、PLLA、SF-PLLA 和 Cultispher G 三種微球接種率分別為 37.67%±2.33%、53.67%±3.69%、73.67%±3.53%。細(xì)胞增殖方面,PLLA多孔微球和SF修飾的PLLA多孔微球細(xì)胞增長(zhǎng)倍數(shù)高于Cultispher G多孔微球。Real-time PCR顯示SF修飾PLLA多孔微球?qū)浌潜硇偷木S持優(yōu)于其他兩組。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),糖胺多糖和Ⅱ型膠原分泌量均為SF修飾PLLA多孔微球組最高。3、多孔微球+透明質(zhì)酸+軟骨細(xì)胞組和透明質(zhì)酸+軟骨細(xì)胞組均可形成軟骨樣組織,組織學(xué)染色觀察兩組鏡下觀無(wú)明顯差別,但是加入微球能提高軟骨塊的硬度和彈性。多孔微球+透明質(zhì)酸+細(xì)胞組隆鼻效果維持時(shí)間最長(zhǎng),透明質(zhì)酸+軟骨細(xì)胞組其次,單獨(dú)透明質(zhì)酸最短。結(jié)論:1、微載體聯(lián)合旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)能夠在大量擴(kuò)增軟骨細(xì)胞的同時(shí)維持良好的軟骨表型,可以作為耳廓軟骨細(xì)胞規(guī)�；瘮U(kuò)增的一種方法。2、與PLLA多孔微球和Cultispher G多孔微球相比,SF修飾PLLA多孔微球更適合軟骨細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)。3、將微球加入透明質(zhì)酸可以改善其作為水凝膠支架機(jī)械強(qiáng)度不足的缺點(diǎn),兩者聯(lián)合使用構(gòu)建可注射組織工程軟骨為注射隆鼻提供了一個(gè)新的選擇。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

微載體三維培養(yǎng)時(shí)，軟骨細(xì)胞可快速貼附于微載體表面，微載體靜止培養(yǎng)２１逡逑天時(shí)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加，將微球包裹，聚集成團(tuán)；微球動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組的細(xì)胞外逡逑基質(zhì)分泌量更多，微球之間結(jié)合更為牢固（圖１．２）；電鏡下更為明顯，微載體靜止逡逑組中微載體上的細(xì)胞量少，微球之間依靠細(xì)胞外基質(zhì)部分相連，動(dòng)態(tài)組細(xì)胞外基質(zhì)逡逑將微球完全包裹，數(shù)個(gè)微球聚集成緊密的小團(tuán)塊。細(xì)胞膜綠色熒光染色（ＤｉＯ）和逡逑冰凍切片ＤＡＰＩ染色顯示：微球中有細(xì)胞生長(zhǎng)，表面黏附的細(xì)胞更多。微球動(dòng)態(tài)組逡逑細(xì)胞數(shù)量多于微球靜止組，而且動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞分布更為均勻（圖１．２）。逡逑ｐｉＫ烰￥

本文編號(hào)：2821076